1、-作者xxxx-日期xxxx血清蛋白的分離、提純與鑒定【精品文檔】血清清蛋白、-球蛋白的分離、提純于鑒定1、 實驗目的： 1、掌握鹽析法分離蛋白質的原理和基本方法 2、掌握凝膠層析法分離蛋白質的原理和基本方法 3、掌握離子交換層析法分離蛋白質的原理和基本方法 4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法 5、了解柱層析技術2、 實驗原理： 蛋白質的分離和純化是研究蛋白質化學及其生物學功能的重要手段。對于不同的蛋白質，其分子量、溶解度及等電點等都有所不同。利用不同蛋白質在這些性質上的差別，利用相應的物理方法可分離純化不同蛋白質。A.鹽析法：在蛋白質溶液中加入大量中性無機鹽后，由于中性鹽與水分子的

2、親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化膜減弱乃至消失。同時，加鹽后由于離子強度發生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，從而破壞了蛋白質的膠體性質，導致蛋白質溶解度降低，蛋白質分子之間易于聚集沉淀，進而使蛋白質從水溶液中沉淀析出。B.凝膠層析：利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadeG-25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒網孔，而分子量小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔中，因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而后洗脫出來，從而達到去鹽的目的。C.離子交換層析:離子交換層析是指流動相中的離子和固定相上的離子進行可逆的交換，利用化合物的電荷性質及電荷量不同進行分

3、離。 D.純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳）：血清中各種蛋白質的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此電泳時可將它們分離為清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5條區帶。3、 材料與方法A材料樣品：人混合血清試劑：葡聚糖凝膠（G-25)層析柱、DEAE纖維離子交換層析柱、飽和硫酸銨溶液、醋酸銨緩沖溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、電泳儀、電泳槽B實驗步驟鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維

4、素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）具體操作流程示意：（一） 鹽析+凝膠柱層析除鹽：取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白)×7cm）×7cm）44AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質44AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質 磺基水楊酸檢測蛋白質 磺基水楊酸檢測蛋白質收集含有蛋白質的峰液12滴收集含有蛋白質的峰液12滴4AC緩沖液洗滌4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測SO42-陰性 BaCl2檢測SO42-陰性4AC緩

5、沖液再生平衡4AC緩沖液再生平衡（二） 離子交換層析（純化）：除鹽后收集的球蛋白×6cm）44AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測蛋白質取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測蛋白質收集含有蛋白質的洗脫液每管10滴，連續收集3管除鹽后收集的清蛋白×6cm）DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白44AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白 磺基水楊酸檢測蛋白質收集含有清蛋白的洗脫液每管10滴，連續收集2管44AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)（三）醋酸纖維素薄膜電泳：1、點樣（如下圖）： - 點樣線 +2c

6、m 點樣區 （粗面） 點樣線盡量點得細窄而均勻,寧少勿多 2、電泳：薄膜粗面向下點樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應輕輕拉平電壓：110V時間：50min 3、染色和漂洗：電泳完畢后，關閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。注意事項：1、所用血清應新鮮，無沉淀物及細菌滋生。2、使用時勿將各時段所應用的溶液濃度弄錯。3、上樣時，滴管應沿柱上端內壁加入樣品，動作應輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時亦應如此。4、洗脫時應注意及時收集樣品，切勿使蛋白質峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，

7、進入空氣。5、切勿將檢測蛋白質的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2混淆，因二者與相應物質生成的沉淀均為白色。6、葡聚糖凝膠價錢昂貴，要回收再生,避免損耗，嚴禁倒掉!4、 結果與討論實驗過程中的現象：加樣時：把飽和硫酸銨加入到血清后觀察到溶液渾濁。溶液下層呈米黃色，上層呈淡黃色。離心后溶液分層為：下層為沉淀，呈乳白色。上層為清液，呈淡黃色。 原始實驗數據：將4條經過染色的醋酸纖維素薄膜并列，使點樣線位于同一水平。以正常血清蛋白圖譜為對照，觀察提純的物質屬哪種蛋白。所得的照片如下圖：結果：從電泳圖譜中可以看出，血清樣品的電泳分離情況并不理想，除清蛋白外，1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋

8、白這4條區帶未能清晰分離。對于清蛋白第1管和清蛋白第2管，其電泳結果與血清的清蛋白電泳圖譜幾乎一致，可以確定管內的蛋白質為清蛋白，同理球蛋白管內的蛋白質為-球蛋白。討論： 1，對于血清樣品的電泳圖譜中4條球蛋白區帶分離情況不佳的情況，其可能為在滴加血清樣品時滴加過多，使得球蛋白的4條區帶彼此靠近而導致分離情況不佳的情況發生。2，對于清蛋白管和球蛋白管中區帶顏色淺的情況，其可能為提純操作中滴加洗脫液過多導致血清蛋白稀釋過度，導致收集的提純蛋白溶液的蛋白濃度降低而使得電泳所得區帶顏色較淺。3，對于清蛋白1管中清蛋白區帶彎曲的情況，其可能為未水平點樣或電泳時薄膜為放正所致。結論：本次試驗所獲得的結果除血清樣品的電泳圖譜外基本與預期試驗結果相一致。思考題：1.硫酸銨鹽析一步,為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?答：因為清蛋白和球蛋白的鹽析濃度不一樣，使用半飽和硫酸銨溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達到分離的目的。-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白?答：因為緩沖液相同并且分離球蛋白后DEAE纖維素柱的成分沒有