1、10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 1授課教師授課教師: : 謝浩謝浩10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 2細胞細胞品種改良，生物制品品種改良，生物制品 (如抗如抗體制備體制備)，醫學用途，醫學用途，培養，改造培養，改造細胞工程實驗室的設置和運行都是為細胞工程服務的。細胞工程實驗室的設置和運行都是為細胞工程服務的。10/2005wuhan university of science and technology xie

2、h.ce1 - 31.細胞培養的基本概念2.細胞培養的基本條件3.細胞培養的基本技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 4ce1-1ce1-1細胞培養的基本概念細胞培養的基本概念10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 51. 什么是細胞/組織培養？2. 體外細胞培養的優點和缺點3. 培養細胞生長的基本條件10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 -

3、 6什么是細胞/組織培養？細胞的體外繁殖propagation of cells outside the organism包括動物組織培養和植物組織培養tissue culture involves both plant and animal cells通過組織培養可以獲得克隆tissue culture produces clones, in which all product cells have the same genotype (unless affected by mutation during culture)10/2005wuhan university of science

4、and technology xie h.ce1 - 7體外細胞培養的優點 細胞株和細胞系的遺傳單一性可由單細胞決定single well defined cell type 培養條件可控制，較易操作controlled conditions，also easy to manipulate 生物材料操作方便superb access 可代替動物試驗alternative to animal testing-model system for discovery of physiological principles-check later on the smaller number of ani

5、mals 可以獲得大量的細胞large quantities of cells can be obtained10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 8體外細胞培養的缺點細胞培養同動物培養完全不一樣not at all like an animalin cell cultures cells are no longer organized into tissuesmonolayer is nothing like a 3d tissue細胞培養環境同體內環境不同environment is not like i

6、n vivoecm scaffolding受血清，血漿等培養條件的影響effects of serum, plasma, etc.“tissue culture can be a powerful technique if conducted properly and a great waste of time and money when done sloppily”bernice martin, ph.d.10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 91. 細胞的營養需要2. 細胞的生存環境 溫度: 37 ，o

7、2 co2: 5%，co2 +h2o h2co3 h+ + hco3- ph: 7.2-7.4 滲透壓3. 無污染4. 無毒培養細胞生長的條件10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 10ce1-2ce1-2細胞培養的細胞培養的設備設備10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 11無菌：無菌：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細胞生長：細胞生長：

8、 純水蒸餾器，純水儀，培養板，培養瓶，co2培養箱，培養基，血清細胞檢測：細胞檢測： 倒置顯微鏡，酶標儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器 細胞保存：細胞保存： 液氮罐10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 12無菌設備：凈化工作室- - 我國藥品生產潔凈室（區）空氣潔凈度標準我國藥品生產潔凈室（區）空氣潔凈度標準 -潔凈度級別塵粒最大允許數/立方米塵粒最大允許數0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,000

9、50010300,00010,500,00060,000na1510/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 13風淋室是生物潔凈室的理想配套設備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風淋室的板壁采用輕質隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進口不銹鋼制作，吹淋口方向可調，風淋時間可在30-99秒間的調整。風淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調，一般控制溫度在30-35較為適宜。無菌設備：風淋室10/2005wuhan university of sc

10、ience and technology xie h.ce1 - 14該裝置是一種潔凈室的輔助設備，主要用于潔凈區與潔凈區，潔凈區與非潔凈區之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數，把對潔凈區的污染降低到最低程度。pb系列傳遞窗按用途分為標準型和生物潔凈型兩種。（后者帶空氣自凈裝置）按門互鎖形式分為機械互鎖和電子互鎖兩種外殼按材料分為彩鋼板型、薄鋼板噴塑型和全不銹鋼型三種通用型尺寸如下表所列，特殊規格按用戶要求制作。無菌設備：傳遞窗10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 15高效過濾器是用超細玻璃纖維紙作濾料

11、，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。 特點：具有低阻高效、輕質、容塵量大等特點，層高的要求，縮小凈化設備靜壓箱體積等優點。適用于常溫常壓常濕條件下環境空氣的凈化，尤其適用于需要高效空氣過濾器覆蓋率高的凈化廠房。無菌設備：高效過濾器10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 16技術性能參數：(1)凈化等級：100級(美國聯邦標準209e)(2)平均風速：0.250.45m/s(可調)(3)噪音：62db(a)(4)電源：220v/50hz層流罩是可提供局部高潔凈環境的空氣凈化設備。它主要由箱體

12、、風機。初效空氣過濾器、高效空氣過濾器、阻尼層、燈具等組成，外殼為不銹鋼或彩鋼板。該產品既可懸掛，又可地面支撐，結構緊湊，使用方便。可以單個使用，也可多個聯接組成帶狀潔凈區域，形成潔凈隧道。潔凈層流罩是將空氣經風機以一定的風壓通過高效空氣過濾器后，由阻尼層均壓，使潔凈空氣呈垂直層流型氣流送入工作區，從而保證了工作區內達到工藝所需的高潔凈度。無菌設備：潔凈層流罩10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 17超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作

13、臺面，使工作臺內構成無菌環境。 無菌設備：超凈工作臺(hoods)10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 18無菌設備：超凈工作臺10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 19 一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環境，保證檢驗、檢測不受污染，又能保證被研究的對象（如病菌、細菌等）不外溢，保護周圍環境及操作人員的安全隔離設備。該設備可廣泛應用于低、中等危險度（病原體1-3，dna重組p1-p3）的臨床細菌學，病毒學、微生物學、組

14、織培養、生物學及生命科學的研究，加工、檢驗部門。無菌設備：ii級a型生物安全柜10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 20紫 外 線 消 毒 主 要 用 于 培 養 室 空 氣 、 操 作 臺 、 塑 料 培 養皿和培養板等表面消毒 無菌設備：紫外燈 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 21干熱消毒（160 ，2小時）主要用干玻璃器皿消毒 無菌設備：電熱干燥箱 10/2005wuhan university of scien

15、ce and technology xie h.ce1 - 22zeisszeiss濾器：濾器：過濾除菌：大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、酶液等均采用濾過法除菌無菌設備：濾器 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 23大容量高壓滅菌器 全自動手提式滅菌器 無菌設備：滅菌器 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 24細胞生長設備：純水儀 10/2005wuhan university of science and te

16、chnology xie h.ce1 - 25pipettes, bottles, flasks, petripipettes, bottles, flasks, petri dishes dishes 塑料- better attachment and cell - better attachment and cell growth of monolayer cell culturegrowth of monolayer cell culture- more expensive than reusable glass- more expensive than reusable glass-

17、suitable for storage at 4c- suitable for storage at 4c 玻璃- can withstand temperatures 0c - can withstand temperatures 0c use for maintaining frozen use for maintaining frozen stocksstocks- steam sterilize by autoclaving- steam sterilize by autoclaving* * relies on steam pressure and high heat relies

18、 on steam pressure and high heat* * use fast-dry cycle to dry condensate use fast-dry cycle to dry condensate* * use “wet” cycle for salt solutions to use “wet” cycle for salt solutions to prevent evaporationprevent evaporation* * loosely place caps on bottles loosely place caps on bottles細胞生長設備：玻璃和

19、塑料器具10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 26細胞生長設備：細胞生長設備：培養容器的選擇majority of vertebrate cells in vitro grow as monolayers on an artificial substratemost cells need to spread out on a substrate in order to proliferateovercrowding will inhibit proliferationbut cells dont like t

20、o be lonelycell yield is proportional to the available surface10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 27細胞生長設備：培養板 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 28細胞生長設備：培養瓶 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 2910/2005wuhan university

21、of science and technology xie h.ce1 - 30sensing and control deviceschamber fans even distribution of heat and gases disadvantage increased spread of contaminationcopper walls are supposed to be antimicrobialco2 deliveryreductors - to change the pressure between a tank and incubator (from about 900lb

22、 to 10-15lb)two or more cylinders with an electronic switchwatch for leaking gas it can be expensive細胞生長設備：培養箱（incubator)10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 31co2培養箱設定的條件為37 ，5co2 。使用co2培養箱培養細胞時應注意的問題：用螺旋口瓶培養細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養箱內空氣干凈。定期消毒 （90 ，14 h)。箱內滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱

23、內濕度，避免培養液蒸發。細胞生長設備：細胞生長設備：co2co2培養箱培養箱 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 32移液器移液器10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 33細胞檢測設備：細胞檢測設備：inverted microscopeinverted microscopeit is vital to look at cultures regularlya morphological change is often th

24、e first sign of deterioration in cultureinverted because it is not good to open tissue culture dishes it should have phase contrast most cells are not dense enough to be visible in a regular light without staining10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 34酶標儀 微孔板震蕩器細胞檢測設備細胞檢測設備1

25、0/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 35細胞檢測設備：細胞檢測設備：高速離心機高速離心機 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 36細胞保存細胞保存設備設備：equipment for equipment for cryopreservationcryopreservation液氮liquid nitrogen liquid phase (-196oc) or vapor phase (-156oc)可調節速凍速率的容器fa

26、ncy freezing chambers to regulate the freezing rate styrofoam containers work too10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 37細胞保存設備：液氮罐細胞保存設備：液氮罐10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 38ce1-3ce1-3細胞培養的基本技術細胞培養的基本技術10/2005wuhan university of science and tech

27、nology xie h.ce1 - 391.實驗室安全2.培養基的成分及配置3.細胞培養的基本操作10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 40實驗室安全實驗室安全：制度：制度1、準入制度2、安全制度3、衛生消毒制度4、出入制度10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 41實驗室安全：實驗室安全：basic safety considerationssafety applies both ways protect your cel

28、ls and protect yourselfgeneral safety rulesaseptic vs. antiseptic technique10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 42實驗室安全：實驗室安全：safety issuesbroken glasssharp instrumentselectricityfrost bite from liquid nitrogen handlingburns (if you use bunsen burner)irradiation if isotopes

29、are usedinfectionchemical toxicitybiohazards10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 43實驗室安全：實驗室安全：safety disinfectionwork surfaces, culture waste and equipment must be kept clean to prevent contamination hypochlorides (bleach)good general purpose disinfectant corrosive against

30、metals (i.e., centrifuges)use at 1000 ppm for general surface use alcohol70% ethanol or 60-70% for isopropanol waste disposaldispose regularly, do not allow to accumulate tissue culture waste (media, pipettes, flasks, etc.)10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 44實驗室安全：實驗室安全：1

31、0/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 45水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無ca2+、mg2+的緩沖液 pbs：nacl8.0 g kcl0.2 g na2hpo4.h2o1.56 g kh2po40.20 g 加水至1000 ml培養基的成分及配置培養基的成分及配置10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 46培養基成分的選擇基本成分附加成分培養基的成分及配置培養基的成分及配置10/2005wuhan universi

32、ty of science and technology xie h.ce1 - 47體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養成功或失敗的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規范,也會導致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 48消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilizat

33、ion)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)和無菌技術/無菌操作(antiseptic technique)細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 49【培養前準備】 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后

34、，因物品不全往返拿取而增加污染機會。細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 50【操作野消毒】 無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺

35、內同時紫外線消毒。細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 51【洗手和著裝】 原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿著細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌

36、操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 52【火焰消毒】 在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。 細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 53【操作】 進行培養時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒

37、灼消毒或取備品更換。 細胞培養的基本操作：細胞培養的基本操作：無菌操作技術無菌操作技術10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 54細胞培養的基本操作細胞培養的基本操作sterilization techniquesmetal - aglass - a, rplastics a, r, gmedium -r, fserum - r, fsalt solutions - a, r, fa-autoclaving, r-radiation, f-filtration, g-gas10/2005wuhan univer

38、sity of science and technology xie h.ce1 - 55filtration sterilization of solutions for maintenance growth or treatment do not autoclave nutrient mediumheat will destroy some of the compounds in the medium pass through sterile filter with small pore size (22 m) use sterile techniques細胞培養的基本操作細胞培養的基本操

39、作10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 56filtrationalways filter through 0.2 m filter to remove bacteria (bacteria are 1-2 m)0.45 m filters remove only particulatesmycoplasma and viruses will still filter throughfilters come in many sizes, all are $ cellulose, polycarbonate,

40、ptfe, best are low protein binding細胞培養的基本操作細胞培養的基本操作10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 57肉眼觀察培養物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態細胞培養的基本操作：培養細胞的觀察細胞培養的基本操作：培養細胞的觀察10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 58細胞培養的基本操作：清潔液的配制細胞培養的基本操作：清潔液的配制 10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 59浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干細胞培養的基本操作：常用玻璃器皿清洗細胞培養的基本操作：常用玻璃器皿清洗10/2005wuhan university of science and technology xie h.ce1 - 60甚至可發生在最好的實驗室happens to even the best真菌fungal - yeast細菌bacterial支原體mycoplasma filterable bacteria which will pass ac