1、pcr技術(shù)詳細(xì)步驟-從rna抽提到電泳鑒定pcr技術(shù)詳細(xì)步驟一從rna抽提到電泳鑒定rna抽提一，準(zhǔn)備工作1, 實(shí)驗(yàn)器具與材料：（1）移液槍：1ml、200uk 10ul（2）吸頭:1ml、200ul 20ul（3）吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)（4）ep 管 1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）鹽水瓶：100ml（8）15ml塑料管一個(gè)（配75%乙醇用）2, 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備（1）塑料制品：（包插吸頭、ep管等）將塑料制品逐個(gè)浸泡于1%cdepc水屮（必要時(shí)小槍頭需要川吸管打入depc水）37°c 過(guò)仗，然后送

2、至高壓3次，后在80°c烘烤箱中烘t （或置于37°c中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前 將槍頭放入吸頭臺(tái)。（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸過(guò)夜，沖洗干凈后，在1%<depc水中泡8小時(shí)左右，37°c烘干，用蒙錫紙包裹 送至干烤3次。（3）金屬制品：（銀子等）先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡depc水）3, 試劑配制和準(zhǔn)備：（1）depc水：泡實(shí)驗(yàn)器具的depc水的配制：1000ml雙蒸水中加imidepc,放 在1000ml容量瓶中靜宣4小時(shí)后備用。配75%乙醇的depc水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝 40ml雙蒸水，加40uldepc, 37

3、6;c過(guò)夜，送至髙壓。（2）75%乙醇（要在抽提時(shí)現(xiàn)配）：用無(wú)水乙醇和depc水配制（depc水:無(wú)水乙 醇= 1:3）,然后放于20°c備用。（3）異丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）trizol： 100ml/瓶 存放于4°c二，抽提時(shí)注意事項(xiàng)：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。三，抽提步驟1. 勻漿化作用取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的trizol溶液，研磨組織后，倒入 1.5mlep管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的trizol溶液洗，后全部再倒入ep管中。顛倒混 勻10下，室溫靜置5分鐘。

4、2. 分離階段每imitrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻, 室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。3. rna的沉淀將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlepffh （約400-500ul）,m 0.5ml異丙醇，混勻后放于20°c中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。34. rna的洗脫小心倒掉上清，留取沉淀。力mml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌rna沉淀一次, jn7500rmp離心5分鐘。5. rna的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時(shí)rna沉淀變透明）。 注意不能讓rna沉淀完全干燥（會(huì)

5、極大地降低它地町溶性）。再在管中加20ul的depc水 溶解，在5560°c下孵育10分鐘助溶。6. rna的保存提取的rna保存于70°c超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。trizol法抽提總rna細(xì)胞1x107組織100mg力nlmltrizol細(xì)胞用1 ml加樣器吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊勻漿（要徹底，厲轉(zhuǎn)至ep管）（組織勻漿量100mg時(shí)分裝1ml/每ep管）顛倒混勻10下，室溫5分鐘加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）顛倒混勻15s,室溫5分鐘14°c,離心 12000rmp, 15分鐘轉(zhuǎn)上層水相（約400-5001）于另一噺1.5mlep

6、管中1加等體積異丙醇（約400 -5001）,混勻后2（tc中1小時(shí)14°c,離心 12000rmp, 10分鐘棄上清加冰預(yù)冷的75%乙醇（用髙壓后的depc水配）1ml4°c離心7500rmp, 5分鐘棄上淸，超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）溶于 depc 水中至20pl (101-201)(可在55-60°c水中，v10分鐘助溶)立即保存于70c超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄4逆轉(zhuǎn)錄(rt)一，準(zhǔn)備工作1, 實(shí)驗(yàn)器具與材料：(1) 移液槍：200uk 10ul(2) 吸頭：200uk 20ul(3) ep 管 1.5ml、100ul(4) 水浴箱

7、2, 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備塑料制品：(包括吸頭、ep管等)將塑料制品逐個(gè)浸泡于1%°depc水屮(必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入depc水)37°c 過(guò)夜，然后送至高壓3次，后在80°c烘烤箱中烘干(或置丁$7°c中8小時(shí)左右烘干)，試驗(yàn)前 將槍頭放入吸頭臺(tái)。3, 試劑配制和準(zhǔn)備：(1) depc水：泡實(shí)驗(yàn)器具的depc水的配制：1000ml雙蒸水中加imidepc,放在 1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的depc水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝 40ml雙蒸水,加40uldepc, 37°c過(guò)夜,送至高壓,后分裝到幾個(gè)1.5mle

8、p管屮，2(tc中 保存?zhèn)溆谩?2) rt中所需耍的各種試劑（3）引物濃度計(jì)算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為x um（pmol/ul）加depc 水體積（ul） = （odx33x1000000） / （分子量xx）%1, rt時(shí)注意事項(xiàng)：為避免rna猶污染，在rt中仍要佩戴一次性手套和口罩。%1, rt步驟用ssiii逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行rt （20ul體積）1, 準(zhǔn)備0.65ml的ep管2, 冰上操作：在ep管中加入10uidepc水，1引物,1ul模板rna, luldntp, 短暫離心。3, 65°c水浴5分鐘后，立刻0°c冰水浴至少1分鐘。4, 短暫離心后,冰上

9、操作:加入4ul 5xfirst-strand buffer, 1ul 0.1mdtt, 1ul rnaseinhibitor, 1ul ssiii逆轉(zhuǎn)錄酶。5, 範(fàn)暫離心6, 50°c水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。7, 70 °c水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶8, 20°c保存，或立即進(jìn)行pcr。用amv逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行rt （10ul體積）1, 準(zhǔn)備0.65mlep 管2, 加入4.5ul depc 水,1ul 引物,1ul 模板 rna3, 稍離心，100°c沸水裕1min4, 加入0.5uldntp, 2ul 5xbuffer, 1ulamv 逆轉(zhuǎn)錄酶5, 稍離

10、心，封口膜封口，42°c水浴90°c作rt6, 100°c沸水裕3min滅活amv7, 立即pcr或20°c保存。5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)二，準(zhǔn)備工作8, 實(shí)驗(yàn)器具與材料：(1) 移液槍：200ul、10ul(2) 吸頭：200uk 20ul(3) 吸頭臺(tái)：放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)(4) ep 管 1.5ml、100ul2, 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備(1) 槊料制品：(包括吸頭、ep管等)送至高壓3次，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。3, 試劑配制和準(zhǔn)備：(1) 雙蒸水：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml蒸懈水，送至高壓，后分裝到兒個(gè)1.5mlep管中, 20

11、c中保存?zhèn)溆谩?2) pcr中所需要的各種試劑三，pcr時(shí)注意事項(xiàng)：佩戴一次性手套，同時(shí)避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。四，pcr步驟1, 準(zhǔn)備100ul ep管2, 依次在管中加入：(50ul反應(yīng)體系)ddh20 37.5ul x?10mm dntp 1ul x?10xpcr buffer 5ul x?25mm mgcl2 （加z前要搖勻）3ul x?上游引物1ulx?下游引物1ulx?模板 cdnaiul3, 稍離心4, 100°c沸水浴1分鐘5, 趁熱加入tag酶0.5（冰上操作）6, 再加入50ul液體石蠟封閉7, wooormp離心1分鐘8, pcr條件94 

12、6;c 1min58 °c 50sec72 °c 1min30sec進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后72°c 10min完后4°c保溫。9, 10ooormp 離心5min10, 將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlep管中，20°c保存。電泳鑒定一，準(zhǔn)備工作1, 實(shí)驗(yàn)器具與材料：（1）移液槍：10ul（2）吸頭：20ul（3）吸頭臺(tái)：放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)（4）三角燒瓶：50ml 個(gè)（5）瓊脂糖2, 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備（1）塑料制品：（包括吸頭等）送至高壓3次，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。（2）電泳板及電泳槽：用白來(lái)水沖洗t凈備用3, 試劑配制和準(zhǔn)備

13、：（1）電泳緩沖液（tae）：先配制0.5mol/l,ph8.0的edta溶液：將37.2g edta-na加入160ml蒸錨水屮，在攪 拌器上劇烈攪拌。在用naoh調(diào)節(jié)溶液ph值至8.0（約需4gna0h）o用蒸館冰足容至200mlo 后送至髙壓滅菌。室溫保存。再配制50xtae溶液：在400ml蒸係水中溶解121 g tris堿 加入28.55ml冰乙酸和50ml0.5ml/l edta溶液，再加蒸飾水定容至500ml,室溫保存。（2）瓊脂糖溶液（1.0% :50xtae溶液取10ml,稀釋成500ml,取50ml溶解0.5g瓊脂糖，電爐i:煮至沸騰，溶 化的瓊脂物冷卻至60°c

14、左右時(shí)加入10mg/ml eb 5ul,充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好 梳子的電泳板中，在室溫下放置45min左右后進(jìn)行電泳。(3) 漠化乙錠(eb) (10mg/ml)：在20ml水中加入0.2g漠化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)。然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移 至棕色瓶中，室溫保存。(4) 加樣緩沖液(loading buffer) 一般為6xloading buffer二，電泳鑒定時(shí)注意事項(xiàng)：佩戴一次性手套，避免皮膚接觸eb。無(wú)路做膠還是電泳緩沖液盡量用新的，不要超過(guò) 兩周。五，電泳步驟i, 50xtae取10ml稀釋成500ml,取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐匕煮沸后加入eb5ul 另外450ml