1、 貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)(玻璃、或塑料等無(wú)活性物質(zhì))的表面生長(zhǎng)、生存和維持。 細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系。 連續(xù)傳代 連續(xù)傳代 連續(xù)細(xì)胞系 有限細(xì)胞系 (已建成的細(xì)胞系) 由具有某些特性與標(biāo)志的細(xì)胞選擇或克隆化而派生的亞系。 細(xì)胞前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)相過(guò)程。 4個(gè)時(shí)期：s期：dna合成期 m期：有絲分裂期 g1期：有絲分裂完成至dna合成開始的間隙期 g2期：dna復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期 g0期：某種原因?qū)е录?xì)胞不再沿周期進(jìn)行，進(jìn)入 休眠狀態(tài) 單個(gè)細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時(shí)間間隔。 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行計(jì)算的細(xì)胞增加一倍

2、所 需要的時(shí)間。 單個(gè)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂形成的細(xì)胞群體，它們的遺傳特性相同。 體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使不同體細(xì)胞融合成雜交細(xì)胞(hybrid)。 器皿中培養(yǎng)的細(xì)胞彼此匯合形成單層。 從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的 培養(yǎng)。 細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)器皿 中培養(yǎng)。 單層細(xì)胞不經(jīng)任何丟失而轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基 中的過(guò)程。 細(xì)胞接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)所形成的集落的百分率。 單個(gè)細(xì)胞 集落 克隆形成率(cloningefficiency) 培養(yǎng)器皿內(nèi)，每單位面積或體積中的細(xì)胞數(shù)(細(xì) 胞數(shù)/cm2)。 特定條件下，培養(yǎng)器皿中能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù) (細(xì)胞數(shù)/cm2或細(xì)胞數(shù)/cm

3、3)。 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)(mem ) 無(wú)血清培養(yǎng)基 無(wú)蛋白培養(yǎng)基 血清基本培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基) 完全培養(yǎng)基 四大類物質(zhì) 無(wú)機(jī)鹽 氨基酸 維生素 碳水化合物 ph指示劑 酚紅 rpmi 1640 應(yīng)用最廣泛 dmem 高糖型 4500g/l 葡萄糖， 低糖型 1000g/l葡萄糖 hamf12 無(wú)血清培養(yǎng)基常用的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基 199 培養(yǎng)細(xì)胞的首選培養(yǎng)基 常用培養(yǎng)基 根據(jù)細(xì)胞株特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)需要選擇 用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)選擇 嚴(yán)格按說(shuō)明書要求添加必要成分 nahco3 谷氨酰胺 hepes - 各成分順序溶解 配制培養(yǎng)基用水、器皿 滅菌 分裝、保存 培養(yǎng)基添加

4、成分培養(yǎng)基添加成分 nahco3 一般按說(shuō)明書要求添加 封閉式培養(yǎng)用5.6%或7.4%液調(diào)節(jié) 谷氨酰胺 易降解，使用前添加 使用終濃度0.002mol/l hepes(羥乙基哌嗪乙硫磺酸) 主要作用為防止培養(yǎng)基ph迅速變動(dòng) 使用終濃度0.01- 0.015mol/l 小牛血清：取自出生1030天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛。 胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎?；蛐呐K穿刺方 法獲得。 提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 (激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白) 提供貼壁和擴(kuò)展因子 (纖連蛋白,層粘連蛋白)。 對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供保護(hù)作用。 抗蛋白酶成分對(duì)細(xì)胞釋放的蛋白酶起中和作用 終止貼壁細(xì)胞消化

5、傳代中所用胰蛋白酶的作用 血清蛋白的粘度保護(hù)懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)細(xì)胞所受的機(jī) 械損傷 改變細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài) 促進(jìn)某些細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)抑制另一類細(xì)胞生長(zhǎng)。 所含物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響或毒性作用 批間成分的一致性 支原體、病毒的潛在污染性 質(zhì)量鑒定報(bào)告質(zhì)量鑒定報(bào)告 理化性質(zhì) 微生物檢測(cè) 促生長(zhǎng)效果(培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)) 克隆形成率、貼壁率測(cè)定 連續(xù)傳代培養(yǎng) 外觀判斷外觀判斷 透明清亮 土黃色或棕黃色 無(wú)沉淀或及少量沉淀 較粘稠 滅活處理: 56水浴, 30分鐘(去除補(bǔ)體) 貯存條件: 分裝 -20 長(zhǎng)期貯存, 避免反復(fù)凍融 4 , 140 代)。 細(xì)胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長(zhǎng),通過(guò)輕輕攪拌使細(xì)胞維持懸

6、浮狀態(tài)。 不增加培養(yǎng)容器表面積或培養(yǎng)基容積的前提下 提高培養(yǎng)表面積。 省卻了容器等的清洗和準(zhǔn)備工作。 細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離簡(jiǎn)單。 減少繁復(fù)的操作步驟,降低污染率。 提高產(chǎn)率。 葡聚糖 纖維素 聚乙烯和二氧化硅, 聚苯乙烯 明膠 單層的培養(yǎng)技術(shù)-皮膚組織獲取和化妝品研發(fā) 培養(yǎng)黑素細(xì)胞-美白化妝品活性成分篩選 朗格罕細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng) -體外篩選化妝品過(guò)敏作用 富含merkel細(xì)胞的表皮細(xì)胞懸液培養(yǎng) -局部應(yīng)用藥物的耐受機(jī)制研究 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) -抗衰老化妝品活性成分開發(fā)中應(yīng)用(篩選中 草藥有效成分的抗衰老活性) -化妝品生理功效研究中應(yīng)用 器官型培養(yǎng)器官型培養(yǎng)(氣氣-液體交界面培養(yǎng)液體交界

7、面培養(yǎng)) 分離、培養(yǎng)皮膚的,使其在體外擴(kuò)增, 然后將其接種于真皮類似物上, 暴露于空氣中, 使表皮正常分化, 形成類似天然表皮的復(fù)層組織(體外重建表皮)。 真皮類似物 去表皮真皮 膠原基質(zhì) 惰性材料 應(yīng)用應(yīng)用 真皮類似物和重建表皮的組合形成具有表皮和真皮 的簡(jiǎn)化的人皮膚。 用成纖維細(xì)胞研究從表皮透過(guò)的化妝品活性物質(zhì)的 生物學(xué)效應(yīng),了解表、真皮之間的相互作用。 將其他細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞)引入真皮類似層,擴(kuò)大測(cè)試系統(tǒng) 的使用范圍。皮膚器官培養(yǎng)皮膚器官培養(yǎng) 活體皮膚于體外培養(yǎng)，并使其保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能 。 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法 液體浸沒的皮膚器官培養(yǎng) 氣-液面交界的皮膚器官培養(yǎng) 應(yīng)用應(yīng)用 化妝品

8、對(duì)皮膚急性刺激毒性研究 在化妝品研發(fā)中的應(yīng)用在化妝品研發(fā)中的應(yīng)用 以皮膚和成纖維細(xì)胞為受試對(duì)象,尋找或篩 選具有抗衰老活性物質(zhì) ,確定該物質(zhì)基本毒性情 況。 (觀察對(duì)兩種細(xì)胞增殖能力及活性的影響) 研究外界因素對(duì)皮膚的藥理學(xué)或毒理學(xué)作用。 (如、藥物及化妝品等) 將損傷作用作為模型進(jìn)行化妝品的干預(yù)研究 將活的黑色素細(xì)胞引入重建真皮類似環(huán)境，作為體外皮膚美白劑的初篩模型。 光生物學(xué)研究, 如防曬劑的效果評(píng)價(jià)。 外來(lái)化學(xué)物的代謝及最初的刺激和過(guò)敏 反應(yīng)。 化妝品的細(xì)胞毒性、有效性研究及局部 應(yīng)用化合物(藥用化妝品、表面活性劑、滲 透劑和殺菌劑等)效果評(píng)價(jià)。 以毛根鞘上皮細(xì)胞為對(duì)象, 進(jìn)行護(hù)發(fā)活性物

9、質(zhì)的篩選以及毛發(fā)用化妝品毒性測(cè)試研究。 皮膚三維培養(yǎng)皮膚三維培養(yǎng)(重建表皮、真皮類似物重建表皮、真皮類似物) -化妝品和洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品對(duì)人體皮膚的刺激性化妝品和洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品對(duì)人體皮膚的刺激性 研究研究 -重建表皮可用于研究表皮終末分化以及研重建表皮可用于研究表皮終末分化以及研 究表皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)物、表皮對(duì)刺激反應(yīng)究表皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)物、表皮對(duì)刺激反應(yīng) 機(jī)制；機(jī)制；化妝品經(jīng)皮吸收和化妝品對(duì)屏障功 能的保護(hù)作用 -真皮類似物用來(lái)研究真皮層的組成及生理 功能 -重建表皮重建表皮+真皮類似物真皮類似物共培養(yǎng)系統(tǒng)用來(lái)研究 皮膚生理代謝、化合物的光毒性、效 應(yīng)和防曬劑的作用 角質(zhì)形成細(xì)胞 黑色素細(xì)胞 朗罕氏細(xì)胞

10、成纖維細(xì)胞 皮脂細(xì)胞 毒性 2,3-細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞形態(tài), 細(xì)胞活性 (中性紅mtt,ldh,peg2) 美白 黑素細(xì)胞培養(yǎng) 黑素的生成 黑素細(xì)胞和 酪氨到酶活性 角朊細(xì)胞共培養(yǎng) 3-細(xì)胞培養(yǎng) 抗衰老 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞增殖, 膠原蛋白, 角朊細(xì)胞培養(yǎng) 彈性蛋白, 3-細(xì)胞培養(yǎng) 粘多糖等的生成 以藥物對(duì)特定依賴細(xì)胞的增殖或抑制、細(xì) 胞數(shù)目的增減為量效指標(biāo)。 細(xì)胞增殖法 : 促進(jìn)特定依賴細(xì)胞株增殖, 抑制增殖法: 抑制細(xì)胞增殖 3h-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法(3h-tdr) 59fe核素標(biāo)記法 四氮唑鹽法(mtt) 直接計(jì)數(shù)法 其他間接法 3h-胸腺嘧啶胸腺嘧啶- 3h-亮氨酸亮氨酸-培養(yǎng)基中摻入

11、3h-亮氨酸，根據(jù) 3h-亮 氨酸在細(xì)胞內(nèi)含量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合 成情況 。 同位素法特點(diǎn)同位素法特點(diǎn) 揭示細(xì)胞分子水平的動(dòng)態(tài)變化,是研究細(xì)胞代謝 狀態(tài)的重要手段。 放射性損害。 需要特殊實(shí)驗(yàn)室和特殊設(shè)備。 乙酰乙酸熒光素法乙酰乙酸熒光素法 當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),細(xì)胞膜的選擇通透性 屏障作用消失,利用乙酰乙酸熒光素和溴化 乙錠快速進(jìn)出細(xì)胞膜受損的細(xì)胞特點(diǎn)。在 熒光顯微鏡下迅速區(qū)分受損細(xì)胞。 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)試發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)試 采用一種獨(dú)特的、穩(wěn)定性熒光素酶來(lái)檢測(cè)有活力 細(xì)胞。熒光素酶利用熒光素、氧和atp作為反應(yīng)底 物，產(chǎn)生氧化熒光 素，并以光的形式釋放能量。由 于熒光素酶反應(yīng)需要atp，因而反應(yīng)產(chǎn)

12、生光的總量 和反映有活力細(xì)胞數(shù)的atp總量呈正比。產(chǎn)生的發(fā) 光信號(hào)和培養(yǎng)基中的有活力細(xì)胞數(shù)呈正比。 特點(diǎn)特點(diǎn) 適用于高通量應(yīng)用，測(cè)試大批量樣品可快速得到 結(jié)果。需要特殊的發(fā)光儀或ccd相機(jī)讀取發(fā)光信號(hào)。 利用鞘流原理,使被熒光標(biāo)記的單個(gè)懸浮細(xì)胞排成單 列,按重力方向流動(dòng)。細(xì)胞被激光照射后發(fā)射熒光,檢測(cè) 器可逐個(gè)對(duì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。 特點(diǎn)特點(diǎn) 對(duì)細(xì)胞測(cè)定能力為30-60萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/分鐘,同時(shí)可對(duì)細(xì) 胞的核酸,蛋白質(zhì)酶、細(xì)胞周期分布等八種參數(shù)進(jìn)行 測(cè)定。 整體動(dòng)物水平 組織器官水平 細(xì)胞分子水平 細(xì)胞系的生物學(xué)特征較為一致，用于觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生理特征的影響，判斷藥物療效及其毒性。 材料用量少，藥物作用機(jī)制較明確，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選，縮短新藥篩選周期