1、 rho激酶抑制劑激酶抑制劑 與糖尿病心肌病與糖尿病心肌病 河北醫科大學第二醫院心內科河北醫科大學第二醫院心內科 李擁軍李擁軍 1. rho激酶的結構和功能激酶的結構和功能2. rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內內 容容rhoa/rockrho為小分子鳥苷酸結合蛋白為小分子鳥苷酸結合蛋白, ,是是ras超家族超家族成員之一。成員之一。rho激酶激酶( (rock)屬于絲氨酸屬于絲氨酸/ /蘇氨酸蛋白激蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是最早發現的酶家族成員，是最早發現的rho

2、a下游效應器。下游效應器。rock有兩個亞基有兩個亞基：兩者在氨基酸序列上有兩者在氨基酸序列上有65%65%的同源性的同源性, , 其中催化結構域的同源性高達其中催化結構域的同源性高達92%92%。 rhoa/rock1. rho激酶的結構和功能激酶的結構和功能2. rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內內 容容rock抑制抑制劑劑目前廣泛應用的目前廣泛應用的rock抑制劑主要有抑制劑主要有fasudil和和y-27632兩大家族。兩大家族。它們它們是非亞基選擇性的抑制

3、劑，既能抑制是非亞基選擇性的抑制劑，既能抑制rock1，也可抑制也可抑制rock2。主要作用于主要作用于rock催化結構域的催化結構域的atp結合位結合位點上，從而抑制點上，從而抑制rock的活性。的活性。較大劑量時亦可抑制其他絲蘇氨酸激酶如較大劑量時亦可抑制其他絲蘇氨酸激酶如pka或或pkc。rock抑制抑制劑劑fasudil 19951995年在日本上市，臨床上用于治療蛛年在日本上市，臨床上用于治療蛛網膜下腔出血術后腦血管痙攣。網膜下腔出血術后腦血管痙攣。是目前唯一可應是目前唯一可應用于臨床的用于臨床的rock抑制劑。抑制劑。hydroxyfasudil是是fasudil的羥化活性代謝產物

4、，的羥化活性代謝產物，其對其對rock具有更高的選擇性。具有更高的選擇性。fasudil的主要不良反應為肝功能損害的主要不良反應為肝功能損害(7.64%), 顱顱內出血內出血(1.63%)和低血壓和低血壓(0.59%)。但有研究者發現應用但有研究者發現應用fasudil治療腦卒中與安慰劑治療腦卒中與安慰劑比較，沒有嚴重的不良事件發生。比較，沒有嚴重的不良事件發生。rock抑制抑制劑劑y-27632是在細胞生物學和是在細胞生物學和藥理學研究中廣泛應藥理學研究中廣泛應用的用的rock抑制劑。抑制劑。statins除調脂作用外，還可通過抑制類異戊二除調脂作用外，還可通過抑制類異戊二烯的生成而影響烯的

5、生成而影響rho蛋白的膜定位功能蛋白的膜定位功能, , 阻斷阻斷rhoa/rock通路，所以它具有摸擬通路，所以它具有摸擬rock抑制抑制劑的效應劑的效應。statins呈現的多效性很多源于它對呈現的多效性很多源于它對rhoa/rock通路的抑制作用。通路的抑制作用。rock抑制抑制劑劑rock抑制劑的藥理作用：抑制劑的藥理作用：（1 1）抑制鈣敏化效應，擴張血管，改善血管功能抑制鈣敏化效應，擴張血管，改善血管功能 失調。失調。 （2 2）抑制炎性細胞的浸潤和粘附，減輕炎性反應。）抑制炎性細胞的浸潤和粘附，減輕炎性反應。（3 3）減少氧化應激，增加）減少氧化應激，增加enos的表達，促進的表達

6、，促進no生成。生成。（4 4）抑制細胞遷移和細胞增殖，減輕組織重構。）抑制細胞遷移和細胞增殖，減輕組織重構。（5 5）抑制肌動蛋白微絲骨架的聚合和一些基因的）抑制肌動蛋白微絲骨架的聚合和一些基因的表達。表達。1. rho激酶的結構和功能激酶的結構和功能2. rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑的藥理作用3. rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內內 容容rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病(1) rock抑制劑與動脈粥樣硬化抑制劑與動脈粥樣硬化rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病（2 2）rock抑制劑

7、與冠心病抑制劑與冠心病 masumoto等發現，對等發現，對冠脈痙攣性心絞痛患者，冠冠脈痙攣性心絞痛患者，冠脈內給予脈內給予fasudil 可明顯減輕可明顯減輕ach誘發的冠狀動脈誘發的冠狀動脈收縮，防止胸痛發作，而對血壓沒有明顯影響。收縮，防止胸痛發作，而對血壓沒有明顯影響。rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病 otsuka等人在為穩定型心絞痛患者行等人在為穩定型心絞痛患者行冠脈造影時，冠脈造影時，首先首先冠脈內給予硝酸甘油冠脈內給予硝酸甘油200gg，而后給予，而后給予fasudil 30mg靜脈輸注，靜脈輸注，分別分別測量管腔狹窄處直測量管腔狹窄處直徑，發現徑，發現fasudil

8、明顯擴張狹窄處的管徑，其效果明顯擴張狹窄處的管徑，其效果優于硝酸甘油。優于硝酸甘油。rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病在日本進行的一個多中心在日本進行的一個多中心期期臨床試驗評估了臨床試驗評估了口服口服fasudil對于勞力型心絞痛患者的療效。結對于勞力型心絞痛患者的療效。結果顯示長期服用果顯示長期服用fasudil可以改善患者的運動耐可以改善患者的運動耐力，且存在量效關系。同時患者對藥物的耐受力，且存在量效關系。同時患者對藥物的耐受性良好，未出現嚴重的不良事件。性良好，未出現嚴重的不良事件。新近，新近，kikuchi等人已將血循環中中性粒細胞等人已將血循環中中性粒細胞上上rock的

9、活性作為心絞痛診斷和病情評估的的活性作為心絞痛診斷和病情評估的指標。指標。rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病（）（）rock抑制劑與高血壓病抑制劑與高血壓病在高血壓大鼠模型中，短期給予在高血壓大鼠模型中，短期給予y-27632，能夠以劑量依賴的方式顯著地降低血壓，能夠以劑量依賴的方式顯著地降低血壓，這提示這提示rock的激活包含在高血壓的發病的激活包含在高血壓的發病機制中。機制中。研究發現將研究發現將fasudil應用于高血壓病的患者，應用于高血壓病的患者，可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血可以增加患者的前臂血流量，降低前臂血管阻力，而對正常人血管則沒有擴張作用。管阻力，而對正常人

10、血管則沒有擴張作用。rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病（）（）rock抑制劑與肺動脈高壓抑制劑與肺動脈高壓(pah)研究證實：研究證實：rock介導的介導的ecs功能失調功能失調、vsmcs 的的過度收縮和增殖、炎性細胞浸潤等過度收縮和增殖、炎性細胞浸潤等都參與了都參與了pah的形成。的形成。fukumoto等人給等人給9 9例嚴重例嚴重pah患者靜點患者靜點fasudil (30mg for 30min)，結果發現結果發現fasudil能能夠降低肺動脈壓力，增加心臟指數，夠降低肺動脈壓力，增加心臟指數，明顯降明顯降低肺血管阻力，且未引起低血壓等付作用。低肺血管阻力，且未引起低血壓等

11、付作用。rock抑制劑與心血管疾病抑制劑與心血管疾病 小結：小結：大量動物實驗和臨床研究表明：大量動物實驗和臨床研究表明：rock抑制抑制劑在防治心血管疾病方面具有巨大的潛力，劑在防治心血管疾病方面具有巨大的潛力，已成為新藥研發的熱點。已成為新藥研發的熱點。有更多的研究正在證實有更多的研究正在證實rock抑制劑的用途抑制劑的用途及其安全性。及其安全性。rock抑制劑的高選擇性將會減少其相關的抑制劑的高選擇性將會減少其相關的毒付作用。目前正在研發亞基選擇性毒付作用。目前正在研發亞基選擇性rock抑制劑。抑制劑。1. rho激酶的結構和功能激酶的結構和功能2. rho激酶抑制劑的藥理作用激酶抑制劑

12、的藥理作用3. rho激酶抑制劑與心血管疾病激酶抑制劑與心血管疾病4. rho激酶抑制劑與糖尿病心肌病激酶抑制劑與糖尿病心肌病內內 容容rock與糖尿病并發癥與糖尿病并發癥 rock與糖尿病心肌病與糖尿病心肌病rhoa/rho激酶信號通路在激酶信號通路在2 2型糖尿病大鼠心肌纖維型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用化中的作用研究背景研究背景糖尿病心肌病是糖尿病一種獨特的心臟并發糖尿病心肌病是糖尿病一種獨特的心臟并發癥。這與糖尿病患者心血管疾病的高發病率癥。這與糖尿病患者心血管疾病的高發病率和高病死率密切相關。和高病死率密切相關。心肌舒張功能障礙是其最早出現的臨床表現心肌舒張功能障礙是其最早出現的臨床

13、表現, ,最終可發展為心力衰竭。最終可發展為心力衰竭。心肌纖維化是其主要的病理改變之一，心肌纖維化是其主要的病理改變之一，在糖在糖尿病心肌病發生、發展過程中起著非常重要尿病心肌病發生、發展過程中起著非常重要的作用。的作用。對糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治療措對糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的治療措施，更好地了解其發病機制并發展新的治施，更好地了解其發病機制并發展新的治療藥物是非常必要的。療藥物是非常必要的。國內對糖尿病心肌病的研究主要應用國內對糖尿病心肌病的研究主要應用1 1型糖型糖尿病模型，對尿病模型，對2 2型糖尿病模型的研究較少。型糖尿病模型的研究較少。研究內容集中在形態學改變和細胞因子水研

14、究內容集中在形態學改變和細胞因子水平上，對細胞信號轉導通路的研究很少。平上，對細胞信號轉導通路的研究很少。研究背景研究背景研究目的研究目的目前，目前，rhoa/rock通路在糖尿病心肌纖維化通路在糖尿病心肌纖維化發病機制中的作用國內外未見報道，發病機制中的作用國內外未見報道，rock的的下游信號分子尚不完全肯定。下游信號分子尚不完全肯定。研究目的：在細胞水平和整體動物水平，探討研究目的：在細胞水平和整體動物水平，探討rhoa/rock、jnk和和tgf1/smad通路在糖通路在糖尿病心肌纖維化中的作用以及相互關系。尿病心肌纖維化中的作用以及相互關系。有可能為糖尿病心肌病確定有效的預防和治療有可

15、能為糖尿病心肌病確定有效的預防和治療靶點。靶點。 第一部分第一部分rhoa/rock通路在高糖誘導通路在高糖誘導大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成中的作用原合成中的作用體外研究體外研究細胞培養細胞培養 5.5mm葡萄糖葡萄糖 ng組組 25mm葡萄糖葡萄糖 hg組組 5.5mm葡萄糖葡萄糖+ +19.5mm甘露醇甘露醇 osm組組 5.5mm葡萄糖葡萄糖+ +fas 50um ng+fas組組 5.5mm葡萄糖葡萄糖+ +fas 100um ng+fas組組 25mm葡萄糖葡萄糖+ +fas 50um hg+fas組組 25mm葡萄糖葡萄糖+ +fas 100um hg

16、+fas組組cf proliferation was evaluated using mtt assay. the data are means sd. n=6; p0.01 vs ng group. *p0.05, *p0.01 vs hg group. 結結 果果the mrna expression of type-i procollagen, rock1 and jnk was evaluated by rt-pcr. n=3; the mrna expression of type-i procollagen was significantly upregulated in hg g

17、roup. 結結 果果immunocytochemical staining for type-i procollagen. . magnification is 400. 結結 果果accumulation of type-i collagen in media was determined by elisa. the data are means sd. n=6; p0.01 vs ng group. *p0.05, *p0.01 vs hg group.結結 果果 結結 果果 the phosphorylation of mypt1 was measured by western blo

18、t analyses. n=3; p0.01 vs ng group. *p0.01 vs. hg group. 結結 果果jnk activity and c-jun protein expression were measured by western blot analyses. n=3; p0.01 vs ng group. *p0.01 vs hg group. 結結 果果 the protein expression of tgf1 and the phosphorylation of smad2/3 was measured by western blot analyses. n

19、=3; p0.01 vs ng group. *p0.01 vs hg group. 結結 論論 結結 論論高糖激活了高糖激活了rhoa/rock通路，介導了心肌成通路，介導了心肌成纖維細胞增殖和膠原合成。纖維細胞增殖和膠原合成。rock特異性抑制特異性抑制劑法舒地爾有效地抑制了高糖誘導的成纖維細劑法舒地爾有效地抑制了高糖誘導的成纖維細胞增殖和膠原合成。胞增殖和膠原合成。高糖環境中，高糖環境中，jnk和和smad2/3是是rock的下游的下游信號分子，信號分子，rhoa/rock通路介導的胞質信號通路介導的胞質信號部分地通過部分地通過jnk和和smad2/3轉入核內，從而調轉入核內，從而調控著

20、相關的基因表達。控著相關的基因表達。第二部分第二部分rhoa/rock通路在通路在2 2型糖尿病型糖尿病大鼠心肌纖維化中的作用及法舒大鼠心肌纖維化中的作用及法舒地爾對心肌的保護效應地爾對心肌的保護效應在體研究在體研究2 2型糖尿病大鼠型糖尿病大鼠普通飼料喂養普通飼料喂養10mg/kg i.p.fasudil治療大鼠治療大鼠糖尿病大鼠糖尿病大鼠對照組大鼠對照組大鼠對照組大鼠對照組大鼠sd大鼠大鼠 高脂飼料喂養高脂飼料喂養6w末末stz30mg/kg i.p.10w末血糖嵌夾末血糖嵌夾24w末結束試驗末結束試驗 實驗設計實驗設計結結 果果結結 果果結結 果果masson staining, magnification, 400結結 果果tem, magnification, 6000 結結 果果sabc staining for type-i collagen (a) and t