1、-作者xxxx-日期xxxx目的基因到工程菌的構建【精品文檔】目的基因到工程菌的構建1基因工程的誕生 1972年，美國斯坦福大學的學者首先在體外進行了DNA改造的研究，他們把SV40（一種猴病毒）的DNA分別切割，又將兩者連接在一起，成功構建了第一個體外重組的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在體外將重組的DNA分子導入大腸桿菌中，成功地進行了無性繁殖，從而完成了DNA體外重組和擴增的全過程。在這個的基礎上，基因工程誕生了。SV40病毒第一個重組體的構建1.1 基因工程技術的三大理論基礎一是20世紀40年代Avery等人通過肺炎球菌的轉化實驗證明了生物的遺傳物質是DNA，而且證明了

2、通過DNA可以把一個細菌的性狀轉移給另一個細菌。二是20世紀50年代Watson和Crick發現了DNA分子的雙螺旋結構及DNA的半保留復制機理。三是20世紀60年代關于遺傳信息中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNARNA蛋白質的方向進行傳遞的。 1.2 基因工程技術的三大技術基礎三大基本技術問題：一是如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需的基因片段切割下來；二是如何將切割下來的DNA片段進行繁殖擴增；三是如何將所獲得的基因片段重新連接。20世紀70年代，由Smith等人發現的核酸限制性內切酶、DNA連接酶和可以作為基因工程載體的細菌質粒的發現，解決了上述三大問題。1.2.1 限制性核

3、酸內切酶 限制性內切酶不切割自身DNA是因為原核生物中不存在酶的識別序列或識別序列已經被修飾。1.2.2 DNA連接酶 作用實質：將具有末端堿基互補的2個DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子，其起作用時不需要模板。1.2.3 基因工程的載體-質粒 基因載體的作用是運載目的基因進入宿主細胞，使之能得到復制和進行表達。也就是說，離開染色體的外源DNA不能復制，而而插入復制子DNA的外源DNA可作為復制子的一部分在受體菌中進行復制，這種復制子 是外源基因的載體。此外，為滿足其使命，還必須具備如下一些特性：能在宿主細胞內進行獨立和穩定的DNA自我復制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持穩定的復制狀

4、態和遺傳特性。易于從宿主細胞中分離，并進行純化。載體DNA序列中有適當的限制性內切酶位點，并位于DNA復制的非必需區內，可以在這些位點上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復制。某些病毒載體在外源DNA插入后變成缺損性病毒株，只能在有輔助存在時才能進行正常增殖。具有能夠觀察的表型特征（有報告基因），在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇標志。1.3 基因工程的基本過程 1.4 基因工程的應用2目的基因的獲取 基因工程訂是通過人工方法分離、改造、擴增并表達生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價值的基因產物。通常我們把插入到載體內那個特定的片段基因稱為“外源基因”，而

5、將那些已被或者準備要被分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段稱為“目的基因”。 來源于真核細胞的產生基因工程藥物的基因是不能直接進行分離的。真核細胞中單拷貝基因只是染色體DNA中很小的一部分，為其10-5 -10-7 ，即使多拷貝基因也只有其10-5，因此從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。另外，真核基因內一般都有內含子，如果以原核細胞作為表達系統，即便分離出真核基因，由于原核細胞缺乏mRNA的轉錄后加工系統，真核基因轉錄的mRNA也不能加工、拼接成為成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必須采用特殊方法分離目的基因。目的基因的獲取大致可以分為三類：一是利用PCR技術甚至化學合成

6、法體外直接合成目的基因，然后將之克隆、表達；二是構建感興趣的生物個體的基因組文庫或者cDNA文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；三是近年來發展的利用基因差異表達獲取目的基因的技術。 直接分離法（鳥槍法） 直接從生物細胞基因組中獲取目的基因最常用的方法是“鳥槍法”，又稱“散彈槍法”。其是將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運載體將這些片段都運載到受體生物的不同細胞中去。只要有一個細胞獲得了需要的目的基因并得以表達，基因工程就算成功了。該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉移到原核生物中去

7、。優點是速度快，簡單易行，成本較低，并能獲得與天然基因組DNA一樣的有內含子的真核基因DNA片段。 逆轉錄法（cDNA法） 逆轉錄法合成DNA是人工模擬自然界某些生物的反轉錄過程。主要用于分子量較大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA為模板，以dNTP為底物，酶催化按53方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈（cDNA），它與RNA模板形成RNA與DNA的雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，由RNA指導的DNA合成過程完成。 反轉錄-聚合酶鏈式反應法（PCR法） 該法是將mRNA經反轉錄全成cDNA的第一鏈，不需再合成cDNA

8、第二鏈，而是在特異引物的協助下，用PCR法進行擴增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。常用于含其極微量mRNA的細胞。2.3.1 cDNA文庫 cDNA文庫是將生物特定的組織器官或特定發育時期的全部mRNA反轉錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達基因的轉錄本。原理是將帶poly（A）的mRNA經酶促反應轉變為雙鏈DNA，再與原核載體連接。 cDNA文庫的構建：2.3.1.1 cDNA第一鏈的合成利用反轉錄酶合成cDNA第一鏈 cDNA第二鏈的合成 自身引導合成法：單鏈cDNA的3端能夠形成發夾狀的結構作為引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow或反轉錄酶的作

9、用下，合成cDNA的第二鏈.此法存在的缺點是在以S1核酸酶切割cDNA的發夾狀結構時，會導致對應于mRNA 5端的地方的序列出現缺失和重排. 置換合成法：以第一鏈合成產物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二鏈.此法的優點是：合成cDNA的效率高；直接利用第一鏈的反應產物，不需純化；避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA。 引物-銜接頭法 Okayama-Berg法合成并克隆雙鏈cDNA 雙鏈cDNA分子的克隆 同聚物加尾法: 利用小牛胸腺末端轉移酶在雙鏈cDNA和質粒

10、載體的3端都加上一個互補的同聚片段，通過退火使兩個片段連接成重組質粒，再將重組質粒轉化受體細胞. 接頭-銜接頭法 mRNA-cDNA克隆法 方法：在mRNA反轉錄合成cDNA第一鏈后，將 dA殘基加到mRNA：cDNA雜交體上，然后與帶dT尾的克隆載體連接，轉化受體細胞， 在宿主細胞內，mRNA被降解并代之以DNA.缺點：克隆的效率低（為雙鏈cDNA克隆的1/10）2.3.1.4 cDNA文庫的篩選和鑒定核酸雜交1）同源探針；至少含有所需cDNA克隆的一部分確切序列.常用于以一個部分克隆分離cDNA文庫中的全長克隆.2）部分同源探針：探針的序列與所要篩選的cDNA克隆的序列相關但不相同.常用于

11、克隆家族基因.3）總cDNA探針：通過反轉錄酶均勻摻入放射性核苷酸或通過總的或分級分離得到的poly(A)+ mRNA進行末端標記而獲得cDNA探針.4) cDNA扣除探針: 從第一種mRNA制備cDNA探針, 連續多次與20倍過量的第二種mRNA雜交; 回收未雜交的cDNA探針, 再與100倍過量的第一種mRNA雜交, 使得原mRNA中的一些特異序列得到高度富集.特異性免疫學檢測:在cDNA表達文庫中，目的基因的表達產物能與特異性抗體發生免疫學反應，通過酶學的方法加以檢測.cDNA克隆的同胞檢測:將cDNA文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易于處理的cDNA文庫，對每組cDNA文庫進行

12、檢測，當鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細的庫進行檢測，直到獲得陽性單克隆.cDNA克隆的確證:cDNA克隆含有編碼某一特定蛋白質的完整氨基酸序列的開放讀框.2.3.2 基因組文庫 基因組文庫或簡稱基因文庫，其是將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。通過構建基因文庫可以貯存和擴增特定生物基因工程組的全部或部分片段，同時又能夠在需要時從基因文庫中調出其中的任何DNA片段或目的基因。 理想的基因組文庫應具備下列條件：重組克隆的總數不宜過大，以減輕從文庫中篩選目標克隆的工作量。克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于從同一克隆中獲得完全的單一基因。含有相鄰DNA片段的獨立克隆

13、間，部分序列重疊的大小合理，一方面利于基因文庫各克隆建立疊連群，進行染色體步查；另一方面，又不重疊過多，使步查效率低下。克隆片段易于從載體分子上完整卸下且最好不帶有任何載體序列。重組克隆應能穩定保存、擴增及篩選。 基因組文庫的構建： 細胞染色體大分子 DNA 的提取和大片段的制備； 載體 DNA 的制備； 載體與外源大片段連接； 體外包裝及基因組 DNA 文庫的擴增； 重組 DNA 的篩選和鑒定。 表型篩選法：表達性狀易于鑒別，如互補篩選 抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐 二氨嘧啶降解，而該化學物可抑制大腸桿菌生長 分子雜交法：利用分子探針對文庫進行篩選 免疫篩選法：利用多肽等作為抗原

14、進行原位雜交篩選 PCR篩選法：根據保守序列合成引物，擴增特異性片段2.3.3 cDNA文庫和基因組文庫的區別 時效性: cDNA 文庫代表某一時期特定細胞或組織中mRAN，是轉錄水平，僅反映某一時期特定組織表達的功能基因，不是全部基因；而基因組文庫包含該生物所有基因。序列組成不：cDNA 文庫無間隔序列和調控區等非編碼區；基因組文庫可真實顯示基因組的全部結構信息，由于制備DNA片段的切點是隨機的，所以每一克隆內所含的DNA片段既可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側的鄰近DNA順序。兩種文庫均有應用，如何選擇： 根據試驗目的，在分離植物RNA、病毒基因、研究

15、植物功能蛋白序列、分離植物特定發育階段或特特異表達的基因時應用cDNA文庫；在研究mRNA不存在的序列及基因組作圖時必須構建基因組文庫。 化學合成法該方法有個先決條件就是必須已知其核苷酸順序，或者已知其蛋白質的氨基酸順序，再按相應的密碼子推導出DNA的核苷酸序列。用化學合成此基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成黏性末端的DNA雙鏈片段。然后將這些DNA片段按正確的次序進行退火連接起來形成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。常用于較小分子蛋白質或多肽的合成。 物理化學方法 其原理是從幾個方面來利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對，T和A配對的這些特性，

16、從而分離目的基因的目的。 密謀梯度離心法 液體在離心時，其密度隨轉軸距離而增加。堿基GC配對的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術可使切割適當片段的不同DNA按密度大小公布開來。進而通過與某種放射性標志的mRNA雜交來檢驗，分離相應的基因。單鏈酶法 堿基GC配對之間有三個氫鍵，比AT配對的穩定性高，當用加熱或其他變性試劑處理DNA時，雙鏈上AT配對較多的部位先變成單鏈，應用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，殖民地經氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA。 分子雜交法 單鏈DNA與其互補的序列總有“配對成雙”的傾向，這就是分子雜交的原理。其既可以分離，也可以鑒別某一基因。3 基因與載

17、體的連接（以質粒為例） 質粒的提取 通過加入SDS（十二烷基硫酸鈉）對宿主細胞進行裂解，使質粒DNA順利溢出并與染色體DNA和蛋白質等分離。其中，微量堿變性法提取質粒具有簡單快速、經濟實惠優點，是當前分子生物學及基因工程研究工作中最常用的一種純化質粒DNA的方法。當然，也可以采用試劑盒進行，目前，商品化產品很多，其基本原理大多是基于堿裂解法結合硅膠模等微型離心純化柱。 質粒載體的構建 天然質粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適合直接用作克隆載體，需要進行人工改造，這些改造主要有以下幾方面：（1）選擇合適的復制起始位點。為了使構建的質粒克隆載體能在受體細胞中進行有效復制，且獲得足夠數量的拷貝數，需要

18、改變復制起始位點，一般選擇組裝松散型質粒復制起始位點。（2）加入合適的選擇標記基因。為了便于重組子篩選，需要在質粒克隆載體上加入合適的標記基因，主要有lacZ和抗生素抗性基因，前者用于克隆子藍、白斑篩選；當外源DNA片段插入到克隆位點后，可導致抗生素抗性基因失活。（3）增加或減少酶切位點。質粒載體利用限制性內切酶識別位點來作為外源DNA片段插入的克隆位點，這種位點必須是單一酶切位點，而且數量越多越便于多種類型末端的DNA插入。可通過刪除天然質粒中的部分重復的限制性內切酶識別位點使之成為單一的酶切位點，可通過增加新的單一限制性內切酶位點在特定的部位組裝一個含有多種單一限制性內切酶識別序列的多克隆

19、位點（MCS）。（4）縮短長度。質粒轉化受體細胞的效率同質粒DNA分子大小相關，小分子質量質粒轉化效率較高。可通過切去質粒上不必要的片段，提高轉化宿主細胞的效率，提高其外源DNA片段的裝載量。 目的基因與載體的連接用一定的限制性酶切割質粒，使其出現一個切口，露出黏性末端；再用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，形成一個重組的DNA分子（重組質粒）。4 重組基因導入受體細胞構建工程菌 4.1 受體細胞的選擇 常用的宿主細胞有如下幾種：DH5a:用于鋪制與培養質粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的b

20、半乳糖苷酶氨基端實現a互補。HB101:用于大規模制備質粒的抑制型菌株，轉化效率高。JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌。JM109:支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌。MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體啟動子質粒載體的宿主菌。4.2 重組質粒轉化受體細胞 常用方法有轉化法；轉導法；轉染法。5 篩選含有目的基因的受體細胞 原理：質粒上的抗生素的抗性基因 方法：利用選擇培養基篩選 工程菌篩選方法.1載體表型選擇法載體表型選擇法是根據載體分子所提供的表性特征，直接選擇重組DNA分子的方法，主要包括：抗藥性標記插入失活選擇法pBR322質粒是分子克隆中最常用的一種載體

21、分子，編碼有tetr ampr使帶有該質粒的宿主細胞能在含有四環素或氨芐青霉素的培養基中生長。具體做法：將此轉化菌先涂布在含有氨芐青霉素的平板上，并將存活的菌落原位影印到另一個含有四環素的夾板上，凡是在氨芐青霉素平板上生長，而在四環素夾板上不生長的菌落上就可能是已經獲得了這種重組體質粒的轉化子克隆。-半乳糖苷酶顯色反應選擇法 除了抗生素抗性篩選之外， 質粒等載體上常用的另一種篩選標志是-半乳糖苷酶顯色反應。當外源DNA插入到載體lacZ上，導致-半乳糖苷酶基因失活，可通過大腸桿菌轉化子菌落再添加由X-gal-IPTG培養基中的著色變化直接觀察出來。.2 根據插入基因的表型選擇法 其基本原理是：轉化進來的外源DNA編碼的蛋白，能夠對大腸桿菌宿主菌株所具有突變發生體內抑制或互補效應，從而使被轉化宿主細胞表現出外源基因編碼的表型特征。這種篩選法受到一定的條件限制，他不但要求克隆的DNA片段必須大到可以包含一個完整的基因序列，而且還要求目標基因能夠在大腸桿菌宿主細胞中實現功能表達。無疑，真核生物基因難以滿足這些要求。其原因在于有許多真核基因是不能對大腸桿菌的突變發生抑制作用或起互補效應。此外，大多數的真核基因內部都存在著間隔序列，而大腸桿菌又不存在真核基因轉錄加工過程中所需要的剪輯機理，這樣便阻礙了他們在大腸桿菌宿主細胞中實現基因