1、乳酸菌的分類鑒定時間：2013年11月乳酸菌目前發 現乳酸菌主要有包括n乳桿菌屬（Lactobacillus ）、n鏈球菌屬（Streptococeus）、n明串珠菌屬（Leuconostoc）、n雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、n片球菌屬（Pediococcus） 等在內的至少 23 個屬。n每個屬下面又發現若干個菌種，菌種下面還有若干亞種，屬于革蘭氏陽性菌乳酸菌鑒定方法n有表型鑒定法（經典方法）和分子標記鑒定法。n表型鑒定法操作方便、成本低，但不能反應乳酸菌的遺傳性信息；n分子標記法快速，但成本相對較高，而且測定的結果與前兩者有不一致的現象。n所以不能只用一種方法對乳酸菌進行

2、鑒定與分類，幾種方法結合起來綜合判斷可能更加準確。一、表型鑒定：兩歧法二、分子水平： n基于PCR的DNA指紋圖譜技術n基于rRNA序列的分子標記技術n種間特異性PCR一、生化鑒定：兩歧法 鑒定對象株 共通項目：共16項 實驗結果記錄 屬間鑒定項目（定屬） 種間鑒定項目 判定種 不能判定種 不能判定種 重復種的鑒定（n1） 追加試驗項目(耐鹽性試驗、精氨酸產氣、肽聚糖類型) 判定種 重復種的鑒定（n2,n1n2） 肽聚糖類型、GC%測定 判定種 重復種的鑒定 DNA同源性 判定種共通項目（16項）：1.生長狀態觀察2.革蘭氏染色3.細胞的形態觀察4.H2O2酶試驗5.硝酸鹽還原試驗6.石蕊牛乳

3、試驗7.明膠液化試驗8.運動性試驗9.葡萄糖產氣試驗10.pH生長試驗11.溫度生長試驗12.糖發酵試驗13.發酵蔗糖產葡聚糖14.發酵類型15.乳酸旋光性16.細胞壁中肽聚糖類型17.精氨酸產氣18.耐鹽性、好鹽性試驗標準菌株: 各種生化特性已研究清楚的標準菌株，可用于檢測試驗的準確性和可靠性。 分離菌株（分離菌株（G+桿菌）桿菌） 過氧化氫酶（過氧化氫酶（- -） 過氧化氫酶（過氧化氫酶（+） 芽孢（芽孢（+ +） 芽孢（芽孢（- -） 非乳酸菌非乳酸菌 Sporolactobacillus 同型發酵同型發酵 異型發酵異型發酵 Lactobacillus Lactobacillus Lac

4、tobacillus Carnobacterium 乳酸菌的分屬乳酸菌的分屬 分離株（球菌）分離株（球菌） 鏈狀鏈狀 四聯四聯 同型發酵同型發酵 異型發酵異型發酵 過氧化氫酶過氧化氫酶 過氧化氫酶過氧化氫酶 （+ +） （- -）Streptococuus Leuconostoc Enterococcus Pediococcus 非乳酸菌非乳酸菌 Lactococcus Streptococcus以明串珠菌屬為例，介紹種的鑒定異性發酵乳酸鏈狀球菌Leuconostoc 發酵蔗糖產酸（發酵蔗糖產酸（+ +） 發酵蔗糖產酸發酵蔗糖產酸(-)(-) 發酵蔗糖產葡聚糖發酵蔗糖產葡聚糖 pH4.8pH4

5、.8生長試驗；發酵果糖生長試驗；發酵果糖 發酵阿拉伯糖發酵阿拉伯糖 發酵阿拉伯糖發酵阿拉伯糖 （+ +） （- -） 群群3 群群4 群群5 發酵海藻糖發酵海藻糖 群群1 群群2 （+ +） （- -） 群群6 6 群群7 7群1：Leuc.oenos群2：Leuc. mesenteroides subsp.cremoris群3： Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides群4： Leuc. mesenteroides subsp.dextranicum 群5： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subs

6、p.mesenteroides群6： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.cremoris群7：Leuc. lactisn注： 方框框起來的是用一般生理生化試驗區分比較困難的，需進一步做分子水平的鑒定；二、分子水平的鑒定n基于PCR的DNA指紋圖譜技術n基于rRNA序列的分子標記技術n種間特異性PCR（一）基于PCR的DNA指紋圖譜技術1.限制性片段長度多態性分析（RFLP）n優缺點： 種內水平，在亞種水平的鑒定優16srRNA；2.隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）n優缺點： 簡單、檢測速度快，不需要知道基因組DNA的任何序列

7、信息即可分析；對反應條件敏感，重復性差，難以達到種的水平；3.擴增片段長度多態技術（AFLP）n優缺點：重復性好，分辨率高，在亞種和菌株水平上對菌株進行鑒定；對操作和設備要求高；4.基因組簡單重復序列PCR標記（Re-PCR）n優缺點：重復性好，可在亞種和菌株水平上對菌株進行快速而準確的分類和鑒定；5.變性梯度凝膠電泳/溫度梯度電泳（DGGE/TGGE）n優缺點：DNA用量小，重復性好，但通常只能檢測微生物群落中數量大于一定值得優勢種群。（二）基于rRNA序列的分子標記技術 原核生物rRNA有3種類型：23srRNA、16srRNA 、5srRNA，對應約含有2900、1540、120個堿基。

8、rRNA 結構既具保守性又具高變性。保守性反映生物物種的親緣關系, 高變性則揭示生物物種的特征核酸序列, 是屬種鑒定的分子基礎。1.16srDNAn 通過用特定引物進行PCR擴增，測序后獲得16srDNA的部分或全部序列，再與數據庫中序列數據進行比對，分析其在發育樹中的位置； 400600堿基的序列足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計, 但這樣短的序列通常不能用于新物種鑒定和探針設計。n鑒定：屬種水平，不能鑒定種內；n引物：通用引物（腸道細菌及其相關細菌） F:ccgaattcgtcgacaac R:agagtttgatcatggctcac全長引物（擴增產物約為1500bp） F：agagtttgatcctggctcag R：aaggaggtgatccagcc2.1623srDNAn不同菌株1623srDNA基因間隔區有相當好的保守性