1、樣本采集與處理樣本采集樣本采集要注意的重點是，所采集的臨床標本 一定要正確和采集的時間合適，并注意采用正確 的標本容器，采集的方法程序對有些臨床標本非 常重要。在疾病發展過程中，標本采集過早或過 晚都可能會給出假陰性結果。盡可能在最短的時間內完成樣本的米集 (應 該保證30min內完成，不適當的處理時間將直接 影響和干擾研究的結果)，應盡快降低所采集組 織樣本的溫度。腫瘤組織標本的采集和處理應遵循嚴格的 生物安全處理規范，也可根據研究者所提出的特 殊要求，按照對方提供的操作模式進行相關處 理。(1)患者入院后進行生物安全性檢查。檢 測HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情況。HIV 感染患者不

2、列為采集對象。HBV及HCV感染者， 須在樣本上明確注明。(3)組織標本取材時間 腫瘤外科手術后， 標本離體30min內。(4)標本米集每種腫瘤主要采集3類生物樣本，并要保證這些樣本的質量和數量能夠用于 DNA RNA和蛋白質提取及滿足相關的實驗分析1）新鮮組織（包括手術和活檢組織）實體組織樣本采集包括外科手術切除的或 活檢和尸檢得到的正常、良性和惡性腫瘤組 織。手術結束后，在臨床腫瘤病理專家的指 導下，在不影響病理診斷取材需要的前提 下，采集組織樣本。A。標本取材部位：腫瘤組織、癌旁組織（癌 組織旁1cm和正常組織（癌組織旁5cm以外 或最遠處）。a）臨床診斷明確，未經放療和化療的手術切 除

3、標本，在病理醫生指導下取材。b）盡量保證癌組織沒有壞死（有壞死的標本 很難提取高質量的RNA和蛋白）。c）配對"癌旁組織"，選擇距離癌灶邊緣3 cn 范圍內的組織樣本，配對“正常組織”，要選 擇距癌灶邊緣5 CM以上或距離癌灶邊緣最遠段（或手術切緣處）取組織樣本，應注明距離。等，“癌旁組織”“正常組織”應取相應部位的“粘膜組織”樣本 d） 在保障病理學檢測所需標本的前提下，盡 量提供足量的腫瘤和癌旁正常組織，一般不少 于200mg或10E7細胞。e）手術切除的組織樣本必須迅速置于液氮中， 然后保存于液氮罐或-80 C冰箱，這一過程盡 量在手術標本離體后30分鐘內完成。f）其

4、中一塊組織可用OCT處理后凍存，可用 于形態學觀察和顯微切割。（OCT（Optimal Cutti ng Temperature） 包埋劑 是一種常用的固形劑。用其包埋組織進行速凍 后，能與組織固定成形，有利于保存組織結構 完整性，便于其形態結構的分析）B。過程：使用數碼相機拍攝標本外觀后， 將標本切成小塊（直徑0.5cm x 0.5cm，厚度<0.5cm）,為減少處理時間，標本不應切得太小， 然后放入凍存管中，標記后放入標本盒中，盒蓋 上附有記錄標本編號、采集時間及標本類型的標 簽。每例病人樣本保存3-5份凍存管標本。每份 組織重量原則上不低于2g。2）石蠟包埋組織a）中性福爾馬林固定

5、手術切除標本按病理學操作規范進行取材b）取材部位包括癌灶，以及癌灶周圍 3cm以 內的癌旁組織，35cm的近癌組織 和5cm以 外的遠癌組織或距癌灶邊緣最遠段分別取 2-3 塊。取材盡量以癌灶為中心水平向兩側取材，盡量保證足夠大的組織樣本。取材應該以“遠 癌-近癌-癌灶"的順序。癌灶處取材包括癌與 正常組織的交界及腫瘤浸潤最深處。所有取材 的組織塊應標明取材部位。c）采集完整的臨床病理和隨訪資料，其中治 療過程和生存期的資料最為關鍵。3）血液（包括血漿、血清）始終遵循標準防護方法，所有操作均要戴手 套。在抽取靜脈血時，應當使用一次性的安全 真空采血管取代傳統的針頭和注射器，因為這 樣

6、可以使血液直接采集到帶塞的運輸管和（或）培養管中。用完后自動廢棄針頭。每例 不低于全血10mL分裝兩份。以全血作為待 測標本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用 EDTA-K3或枸櫞酸鈉，不可使用肝素。全血樣 本如用于DNA提取檢測，可4 C下短期保存，如用于RNA僉測，則應在取血后盡快提取RNAa）及時采集入組病例的外周血標本，初診患者3-5 ml，EDTA抗凝，30OOrpm離心，血漿和 有形成份（白細胞成分）分別用統一質量標準 的容器保存（盡量在2h內完成血漿的分離工 作）。b）特殊病例要保存治療前后的外周血標本各5 ml （血漿或血清）。c）采集的血漿或血清樣本在無菌條件下分裝， 0.5

7、-1 mL/每管，用螺紋口管，-80 C保存。d）手術前后血漿或血清，明確臨床診斷后在 術前取血，術后第14天或出院前取血。e）化療前后血漿或血清采集按照臨床試驗操 作規程和技術標準制定。f）非癌患者/正常對照血漿或血清樣本，選擇 年齡、性別與實驗組相匹配的非癌患者為對 象。2、根據研究課題的具體目標，所采集的生 物樣本主要用于3類實驗研究：1）測試樣本：主要用于基因、蛋白表達譜 建立，基因組測序分析，樣本質量優先。主要考慮的因素為腫瘤分型和分類，每一類型要達到統 計學小樣本數目。2）驗證樣本：主要用于標志基因變異的確認'進行 RT-PCRWBIHC/ISH、突變檢測、ELISA 的實

8、驗分析。主要考慮的因素為腫瘤分型、分類 和分期，包括不同階段癌前病變組織樣本， 病理 學診斷要明確，每一類型要保障統計學大樣本數 目。3）分型樣本：主要用于腫瘤標志基因或蛋 白的大樣本、多中心臨床驗證，包括IHC, ELISA, REAL TIME RT/PCR基因/蛋白臨床檢測芯片的 分析。臨床隨訪資料和生存期為考慮的主要因 素，每一類型要保障符合多中心、 大樣本的統計 學要求。米樣及運輸容器標本的采集材料如棉簽、拭子等均應為一次 性使用，采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關試劑 材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如全 血、和血漿樣本，首先要抗凝，抗凝劑的選擇很 重要。一般應使用EDTA和構櫞

9、酸鹽作為抗凝劑， 肝素因其對PCRT增有很強的抑制作用，且在后 面的核酸提取中很難去除，故應盡量避免使用。 此外，標本運輸中的保存液對其有稀釋作用， 因 此應考慮稀釋對測定的影響。現已有廠商專門有 用于PCR僉測標本采集的無核酸酶容器供應。樣本采集中的防污染樣本采集最好采用一次性無菌及無核酸酶的材 料，不用處理便可直接使用，采集中要特別注意 污染，防止混入操作者的頭發、表皮細胞、痰液 等。如使用玻璃器皿，必須經 0.1%DEP（水處理 后高壓，以使可能存在的RNase失活，并降解對 PCF有抑制作用的DEPC采樣質量的評價血清（漿）標本可觀察標本是否溶血、脂血及 其程度，并明確這種情況是否會對

10、相應的檢測造 成影響。總而言之，標本的收集及適當的預處理，對用 于PCF測定的核酸模板的成功提取，具有決定性 作用。附件5 腫瘤樣本采集的基本技術標準（適 用于部分小量生物樣本提供單位使用）1. 所有入組病例要按要求采集腫瘤組織標 本、血液和具有臨床檢測意義的體液。2. 送檢腫瘤組織和血液標本最好在未經放 療和化療前采集。3. 送檢腫瘤標本必須病理診斷明確，盡量 保證有足夠多的癌細胞（50%上為好）。4. 癌組織沒有壞死。（有壞死的標本很難提 取高質量的RNA和蛋白）5. 在保障病理學檢測所需標本的前提下，盡量提供足量的腫瘤標本和癌旁正常組織，至少 1-2 克。6. 手術標本必須迅速置于液氮中

11、，然后保存 于-80 C或-130 C冰箱，這一過程要求在手術離 體后30分鐘內完成）。7. 如果不能提供與病理學檢測平行的活檢 組織標本，至少提供5-10張組織切片。8. 要提供與病理學檢測平行的石臘組織塊或福爾馬林固定組織標本，或至少提供5-10張組織切片。9. 提供腫瘤脫落細胞涂片或組織印片 5-10 張10. 及時采集入組病例的外周血標本，初診患者5-10 ml，EDTA抗凝，3000rpm離心，血 漿和有形成份分別用統一質量標準的容器保存。 特殊病例要保存治療前后的外周血標本各5 ml（血漿）。附件8 （供參與國際合作的課題組參考） 國際腫瘤基因組協作研究（ICGC腫瘤組織樣本 質量

12、標準三、樣本質量標準及操作規范：1. 在ICGC計劃實施一開始，就應保證所 采用的腫瘤類型和樣本的高度均一性。2. 在ICGC計劃實施的一開始，應保證使 用的腫瘤樣本未經過任何治療，即原發灶，不要 復發的腫瘤組織樣本，解剖學上為單一起源，并 能代表單一組織學類型或亞型，（最好為同一組 織病理學級別）。3. 采用樣本中的腫瘤細胞要在80姬上, 壞死細胞或正常細胞（炎性細胞，免疫細胞，間質 細胞或癌前病變細胞）應少于20%某些種類的 腫瘤,可能需要適當降低以上標準，但是如果腫 瘤細胞數低于60%寸,就需要考慮利用一些物理 的方法進行富集。4. 需要備有組織學鑒定的文檔和圖像資料 能夠提供給從事特定

13、腫瘤的研究者參考。要明確評估組織的等級1）壞死;2）碎片;3）炎性組織;4） 纖維化；7. 原則上,每例樣本需要200 mg實體瘤組 織或10E7流式細胞儀分選的細胞（血液腫瘤）。 如果必須采用顯微切割分離細胞，具體需要多少 細胞還不確定，需進一步明確。8. 雖然需要提取多種大分子，但首先考慮 提取高質量的DNA同樣能夠提取高質量的RNA樣本處理全血標本血清的分離是臨床樣本收集中的一項重要 內容，所得血清可用來直接檢測樣本中腫瘤抗原 和（或）抗體；分析血清中某種標志物以及相關 蛋白表達，進行細胞因子以及DNA和蛋白質的定 性和定量分析。臨床腫瘤標本庫主要采集接受腫 瘤外科手術患者之全血標本，采

14、集分為術前、術 后兩部分。（1） 術前血指臨床診斷明確，患者未經 任何治療，即放療、化療及免疫治療等，已接受 上述治療的患者樣本需詳細注明。（2） 術后血指接受手術后2周，患者未 接受任何治療，即放療、化療及免疫治療等。采集血清操作時要嚴格注意安全防護，避免 對人、環境造成污染，需認真注意以下事項：1）人員要求：操作時應戴手套以及眼睛和 粘膜的保護裝置。只有經過嚴格培訓的技術人員 才能進行這項工作。2）實驗操作技術要求：規范的操作可以避 免或盡量減少噴濺和氣溶膠的產生。血液和血清 應當小心吸取，而不能傾倒。嚴禁用口吸液。3）移液管使用后應完全浸入適當的消毒液 總。移液管應在消毒液中浸泡適當的時

15、間， 然后 再丟棄或滅菌清洗后重復使用。4）帶有血凝塊等的廢棄標本管，在加蓋后 應防止在適當的防漏容器內高壓蒸汽滅菌和（或）焚燒。5）應備有適當的消毒劑來清洗噴濺和溢出標本。步驟(1) 取血液標本，每例米集10mL (不少于5mL , ACD(構櫞酸鹽葡萄糖抗凝劑)抗凝(或 肝素、EDTA首選ACD其次EDTA，用于細胞 培養的血液標本，室溫保存；準備DNA提取的血 液標本，4°C保存。約10mL全血分裝入紅帽管(不 含抗凝劑)和紫帽管(含2%EDT抗凝劑)中。(2) 紅帽管用于分離血清，室溫放置30min 后離心。紫帽管用于分離血漿。(3) 盡快離心(30min內)。此時懸液分為

16、三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，在紅 細胞層上呈灰白色的白細胞層為外周血淋巴細 胞。(4) 輕輕吸取淡黃色血漿上層液放入 1.5mL 離心管中，每管100卩L,共9管，余液放入1 管中。做好標記，P代表血漿，S代表血清。(5) 編號后放入-80 C低溫冰箱保存。組織組織樣本可立即固定，備病例診斷用；或分 割后，采取不同方式進行保存。樣本DNA RNA勺提取 按常規實驗方法提取腫瘤組織和癌旁、正常組織的基因組DNA總RNA石蠟切片用于核酸 提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶 K 消化后即可進行DNA提取。新鮮組織塊的處理步 驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切 碎，加入生理鹽水后

17、劇烈震蕩混勻，離心，棄上 清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。3 組織芯片制備組織芯片制作流程包括：陣列設計、入選樣 本病理復診與標記、取芯（供體蠟塊）、點陣（受 體蠟塊、切片制成組織芯片）：1）檢測芯片：主要用于檢測標志蛋白表達 狀況和水平，可以使用具有明確臨床病理學資料 但隨訪時間短或無患者生存期的組織標本制備。2）分型芯片：在用于檢測標志蛋白表達狀 況和水平的基礎上，能夠用于臨床分子分型研究 和評價。所用的組織要求有系統的臨床隨訪和生 存期資料，這是一個關鍵問題。樣本保存1. 采集的生物樣本分裝、標記和保存是十分 重要的，有些樣本要在幾年或更長的時間以后才 會用于實驗研究，因此質量監控和檢索

18、的方便尤 為關鍵。要保證實驗樣本的質量和數量能夠在若 干年后用于DNARNA和蛋白質提取和實驗分析。2. 所有生物樣本應分裝貯存，盡量避免多 次反復解凍。長期保存樣本的最適保存條件為在 液氮或-135 C保存。3. 生物樣本的容器應采用螺口的凍存管， 能夠在低溫下長期儲存，玻璃管或彈出式蓋子的 管子不適合長期儲存。標本儲存分為組織標本保存和提取物保存 兩大類。1. 組織標本保存（1）新鮮標本：可用來保存新鮮標本的實 驗體系包括：細胞培養液、緩沖液如磷酸鹽緩 沖液（PBS 、核酸保護劑（如 RNA laterTM ） 中，或直接做干燥處理，或于室溫保存或置于冰 浴中。組織標本可在切割后的24h內

19、轉送到研究 者的實驗室中。新鮮組織最好是保存于 50聽醇 中，具體做法是，先用生理鹽水將組織洗 1次,切成寬度1cm的小片，加入適量的生理鹽水， 然后，邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為 50%這 樣固定的組織標本室溫下可保存數日，4C可保存6年。（2）凍存標本：標本凍存管可直接凍存于 液氮，再轉移到-70 C冰箱，或OCT包埋后儲存 于液氮或-70 C。標本在運送過程中，可將其置 于冰中保存。（3）石蠟固定標本：采用石蠟包埋，蠟塊 編號，分類存放。定期整理液氮保存樣本，移入-80 C低溫冰 箱內長期保存。2. 血清樣本保存編號后分裝、低溫凍存，可置于-20 C、-70 °C 冰箱或液氮罐

20、中。有研究表明，用于 RNA測定， 最好是使用EDTA抗凝（嚴禁使用肝素，因其對 PCF擴增有抑制作用，且很難再核酸提取過程中 完全去除）全血標本，抗凝后 6h內分離血漿， 如使用血清標本，則需盡快（2h內）分離血清， 標本的短期（1-2周）保存可在-20 C下，較長 期保存應在-70 C下。3. 體液標本臨床體液標本包括胸腔積液、腹水、腦脊液、 尿液等，可按水樣標本的方式離心去沉淀后， 提 取核酸。臨床體液標本長期(超過2周)保存應 在-70 C下。4. 提取物保存按常規實驗方法提取腫瘤組織和癌旁、正常 組織的基因組DNA總RNA定量后分裝提取的 核酸，保證每份標本可供五個研究者使用，具備

21、50-100次核酸研究用量，并保存使用記錄。由于靶核酸(尤其是RNA易受核酸酶的作 用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測 定的有效性極為重要。檢測靶核酸為DNA的標本，可在2-8 C下保存3d,也可于10mmol/L Tris ， 1mmol/L EDTA (pH7.5-8.0 )緩沖液中 4C下保 存。而檢測靶核酸為RNA勺標本，一旦采集送到 實驗室后，則應在-20 C以下凍存。為使臨床標本中可能存在的核酸酶失活， 可 加入chaotropic 物質，最常用的是4mol/L異硫 氰 酸胍鹽 (Guanidinium isothiocyanate ， GITC)，并同時與還原劑如3 -巰

22、基乙醇或二巰基 乙醇一起使用。使用終濃度為 5mol/L的GITC, 可使RNase不可逆的失活，如濃度4mol/L則失 去對RNase的抑制作用，而使RNA迅速降解。使 用GITC作為穩定劑保存靶核酸為 RNA的標本， 標本可在室溫下穩定約 7d。此外，如測定的靶 核酸為血循環中的RNA為避免室溫放置過久而 致RNA的降解，最好不要使用血清標本，而應使 用EDTA抗凝后盡快分離后的血漿標本。臨床標本置于經過處理的濾紙片上，如靶核 酸為DNA可室溫保存數月至數年，如靶核酸為 RNA則可穩定數周。研究表明，保存在濾紙上 的標本，保存時間長，還可因為標本中的PCR抑 制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙 上,而不對后面的擴增檢測造成影響。 標本加于 濾紙片上，對于標本的室溫運送非常方便， 適用 于特定病原體的