1、生物素、親和素標(biāo)記技術(shù)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科廖偉嬌一、生物素及其理化性質(zhì)1 概念2 分子式3結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4溶解特性5等電點(diǎn)6其它特性 1 概念： 生物素(biotin)是動、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶r或維生素h。2分子式： c10h16o3n2s 分子量：244.313結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 咪唑酮環(huán)/四氫噻吩環(huán) 結(jié)合親和素 側(cè)鏈末端羧基結(jié)合蛋白質(zhì)4溶解特性： 難溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(dmf)5等電點(diǎn)： ph=3.56其它特性： 羧基需經(jīng)活化修飾才能結(jié)合蛋白質(zhì) （羧基活化的生物素，稱為活化生物素，也叫生物素衍生物）2生物素衍生物的種類及特性： 1 生物素羥丁酰亞胺酯(bnhs

2、)： dmf制備：生物素 + n-羥基琥珀酰亞胺 二環(huán)己基碳二亞胺標(biāo)記特點(diǎn)： bnhs中的羧基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸氨基 結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的適用于：標(biāo)記ab、酶、中性或偏堿性ag、dna2長臂活化生物素(bcnhs)： dmf + 6-氨基己酸制備：生物素 + n-羥基琥珀酰亞胺 二環(huán)己基碳二亞胺 (在bnhs的b與羧基之間插入2分子的6-氨基己酸 ）標(biāo)記特點(diǎn): (同bnhs) bcnhs中的羧基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸氨基結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的適用：(同bnhs) 標(biāo)記ab、酶、中性或偏堿 性的ag、dna3 生物素酰肼(bhz)：制備：生物素 +水合肼標(biāo)記特點(diǎn)： bhz與蛋白質(zhì)中的醛基結(jié)合而標(biāo)記適用：標(biāo)

3、記偏酸性的蛋白質(zhì)、酶、dna三、親和素及其理化性質(zhì)1 概念2 分子式3結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4溶解特性5等電點(diǎn)6其它特性1 概念： 親和素(avidin)：是動物微生物中提取的一種含10%碳水化合物的堿性糖蛋白。 鏈霉親和素：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質(zhì)2 分子量： a: 6.7kd sa: 66.5kd3 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 每分子由四個亞基組成4溶解特性：溶于水，c=5mg/ml 5等電點(diǎn)： a: ph=10.5 sa: ph= 6.06比活性： a12u/mgp sa 14u/mgp四、親和素的活性及其測定1 親和素的活性：是表示親和素結(jié)合生物素的能力，即：ugb/mga或ugb/mgsa。2活性

4、測定： 羥基偶氮苯-2-羧酸(haba)法： a(sa) + haba（紅色） b a-b （出現(xiàn)黃色時b的量） 分光光度法：五、生物素標(biāo)記物及親和素標(biāo)記物的制備：1 生物素標(biāo)記物的制備： b +ab/ag/e 交聯(lián)劑 b-ab/ag/e2親和素標(biāo)記物的制備： a/sa+ ab/ag/ e 交聯(lián)劑 a/sa-ab/ag/e六、技術(shù)類型： 可有ag與ab反應(yīng)的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在次基礎(chǔ)上引入a-b系統(tǒng)。1bab法： ag+bab ag-abb a ag-abb-a be ag-abb-a-be 特點(diǎn)：以游離a分別連接b-ab和b-e 返回2ba法： ag+bab ag-abb ae ag-abb-a-be特點(diǎn)：以a-e/sa-e代替bab法中的a，省 卻了加b-e的步驟3abc法： a+be a- be-abc ag+bab ag-abb abc ag-abb-abc 特點(diǎn)：將bab法中的a先與b-e結(jié)合，制備成復(fù)合物abc返回+a+a ag-ab1-ab2-b + a