1、 組織制片技術的概述組織制片技術的概述 組織制片技術的方法組織制片技術的方法 組織制片技術的基本程序組織制片技術的基本程序 蘇木精蘇木精伊紅染色伊紅染色 組織制片技術的發展史組織制片技術的發展史 從從16世紀世紀60年代年代hook發明顯微鏡，開始觀察發明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細胞至今，組織制片技術隨著生和描述軟木塞中的細胞至今，組織制片技術隨著生命科學的發展而不斷進步。命科學的發展而不斷進步。 組織制片技術的發展史組織制片技術的發展史 在在19世紀中期，隨著生物、物理和化學等學科世紀中期，隨著生物、物理和化學等學科的飛速發展，以及顯微鏡和切片機的逐步完善，組的飛速發展，以及顯微鏡和

2、切片機的逐步完善，組織學也建立起一整套完整科學的組織制片技術。織學也建立起一整套完整科學的組織制片技術。 組織制片技術的發展史組織制片技術的發展史 特別是特別是20世紀世紀50年代以來，由于組織化學、年代以來，由于組織化學、免疫組織化學等新技術和新儀器的出現，使組織制免疫組織化學等新技術和新儀器的出現，使組織制片技術的應用領域進入了一個嶄新的時期。片技術的應用領域進入了一個嶄新的時期。 組織制片技術的方法組織制片技術的方法 非組織切片法非組織切片法 組織切片法組織切片法 非組織切片法非組織切片法 組織不經過切片制成觀察標本的方法。組織不經過切片制成觀察標本的方法。非組織切片法的種類非組織切片法

3、的種類 涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標本、涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標本、活體標本、整裝標本、血管注射標本。活體標本、整裝標本、血管注射標本。磨片：對于骨，牙齒等組織，不經脫鈣和切片，磨片：對于骨，牙齒等組織，不經脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，微米左右的薄片，然后再進行染色封固在載玻片上。然后再進行染色封固在載玻片上。消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用消化分離標本：先將組織分離成小塊，然后利用相應的化學物質將細胞間質消化溶解，再用機械相應的化學物質將細胞間質消化溶解，再用機械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分分離的

4、方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個而又完整的細胞，經染色后涂于載玻片離成單個而又完整的細胞，經染色后涂于載玻片上進行封固。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動上進行封固。例如平滑肌分離標本，脊髓的運動神經細胞等。神經細胞等。 活體標本活體標本 將所采的觀察標本加生理鹽水后直接將所采的觀察標本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。整裝標本整裝標本 將胚胎或小動物經前期固定后整體將胚胎或小動物經前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明容器中封藏于盛滿固定劑的透明容器中 。將發育至某一將發育至某一階段的雞胚整體取出，經固定、染色、脫水、透明階段的雞胚整體取出，經固定

5、、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標本。后封固于載玻片上的標本。血管注射標本血管注射標本 將有色物質注射進血管，用酸將有色物質注射進血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標本。管標本。 將有色物質注射進血管后，經一系列制將有色物質注射進血管后，經一系列制片技術處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標片技術處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標本。本。組織切片法組織切片法 利用化學試劑將組織經過一系列的固定、脫利用化學試劑將組織經過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物

6、滲透進組織內部，使組織保持一定的硬度，持物滲透進組織內部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機將包埋好的組織塊并包埋成塊，然后依靠切片機將包埋好的組織塊切成以微米計的薄片，再根據需要進行各種染色切成以微米計的薄片，再根據需要進行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。得到的供顯微鏡下觀察的標本的方法。 冰凍切片冰凍切片 將所取材的新鮮組織，經將所取材的新鮮組織，經快速冷凍后再切片，以保快速冷凍后再切片，以保持組織內所含的脂類或某持組織內所含的脂類或某些酶類的活性。些酶類的活性。 為觀察急待結果的組織，為觀察急待結果的組織，如臨床手術所取組織，也如臨床手術所取組織，也可用這種方法。

7、可用這種方法。 組織切片標本制作的基本程序組織切片標本制作的基本程序: 1. 取材取材 2. 固定和固定后處理固定和固定后處理 3. 脫水脫水 4. 透明透明 5. 浸蠟與浸蠟與包埋包埋 6. 切片切片 7. 染色染色 8. 封固封固 取取 材材一、動物的處死一、動物的處死 手法迅速、快捷。手法迅速、快捷。 常用方法：常用方法： 1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。戊巴比妥）。 2. 空氣栓塞法空氣栓塞法：耳靜脈，：耳靜脈，2030ml空氣空氣 3. 擊頭法：重物猛擊，迅速致死。擊頭法：重物猛擊，迅速致死。 4. 頸椎脫

8、臼法：頸椎脫臼法：小白鼠小白鼠 5. 破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙 6. 股動脈放血：麻醉后放血使大動物迅速死亡。股動脈放血：麻醉后放血使大動物迅速死亡。二、取材的步驟二、取材的步驟 1. 選擇動物選擇動物2. 選擇取材部位選擇取材部位3. 選擇切面方向選擇切面方向 應根據實驗工作的目的和經濟能力選擇實驗動物應根據實驗工作的目的和經濟能力選擇實驗動物 肝臟肝臟豬肝豬肝 卵巢卵巢貓貓 胃胃狗狗 運動終板運動終板爬蟲類動物爬蟲類動物 肥大細胞肥大細胞大、小白鼠的皮下組織大、小白鼠的皮下組織 間皮和內皮間皮和內皮蛙的腸系膜蛙的腸系膜 根據器官組織的結構特點選擇取材部位根據器官

9、組織的結構特點選擇取材部位 胰腺胰腺胰尾部胰尾部 脊髓的運動神經元脊髓的運動神經元頸膨大和腰膨大處頸膨大和腰膨大處 肺肺 肺門肺門 胃胃胃底部胃底部 根據器官組織的結構特點選擇取材時切面的方向根據器官組織的結構特點選擇取材時切面的方向 腎臟腎臟腎門處作縱切腎門處作縱切 頭皮頭皮順毛根的方向縱切順毛根的方向縱切 大小腸的環行皺襞大小腸的環行皺襞縱切縱切氣管和食管氣管和食管橫切橫切三、取材時應注意的問題三、取材時應注意的問題 ： 組織新鮮：取材動作快捷，迅速投入固定液組織新鮮：取材動作快捷，迅速投入固定液 注意環境溫度的影響：冰上取材或者冷固定注意環境溫度的影響：冰上取材或者冷固定 材料應小而薄：

10、材料應小而薄： 不超過不超過1.51.5 0.5cm3 固定液會造成組織收縮，注意保持組織原有形態固定液會造成組織收縮，注意保持組織原有形態 取材手術器械鋒利規范操作，防止組織損害取材手術器械鋒利規范操作，防止組織損害 注意取材環境和器械干凈，防止組織污染注意取材環境和器械干凈，防止組織污染固定和固定后處理固定和固定后處理一、固定的目的一、固定的目的 ： 固定劑使細胞的成分凝固，防止組織細胞固定劑使細胞的成分凝固，防止組織細胞自溶和腐敗，保持細胞生活時的狀態。自溶和腐敗，保持細胞生活時的狀態。 固定劑的酶染作用使細胞各成分易于被染固定劑的酶染作用使細胞各成分易于被染料著色。料著色。 使組織適度

11、硬化，利于制作薄片。使組織適度硬化，利于制作薄片。二、固定的方法：二、固定的方法： 1. 直接固定：最常用。直接固定：最常用。 2. 蒸汽固定：蒸汽固定：12鋨酸或者甲醛揮發的蒸鋨酸或者甲醛揮發的蒸汽，多用于涂片固定。汽，多用于涂片固定。 3.灌注固定：（必須進行后固定灌注固定：（必須進行后固定） 局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟 全身灌注固定：神經系統全身灌注固定：神經系統三、固定的注意事項：三、固定的注意事項：1. 固定劑的用量固定劑的用量 一般為組織塊體積的一般為組織塊體積的15倍左右倍左右 2. 固定劑的配制固定劑的配制 現配現用現配現用3. 固定的

12、時間固定的時間 受較多因素的影響。一般過夜或者受較多因素的影響。一般過夜或者24小時小時可達到固定要求。可達到固定要求。 四、常用固定劑四、常用固定劑單純固定劑單純固定劑 甲醛甲醛、乙醇乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重鉻重鉻酸鉀、丙酮、酸鉀、丙酮、 鉻酸、四氧化鋨鉻酸、四氧化鋨 固定組織時，只單用某一種試劑尚難對各種組固定組織時，只單用某一種試劑尚難對各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據對組織的作用與反應，配成混合固定劑，劑，根據對組織的作用與反應，配成混合固定劑，以求得補償某試劑對組織所致的缺陷。以求得補

13、償某試劑對組織所致的缺陷。混合固定劑混合固定劑 中性甲醛液中性甲醛液、乙醇乙醇甲醛液甲醛液、 bouin氏液氏液、 苦味酸苦味酸硫酸液硫酸液 、carnoy氏液氏液 、helly氏液氏液甲醛甲醛(formeldedhyde)固定濃度：固定濃度： 4%甲醛溶液甲醛溶液固定時間：固定時間： 12小時小時24小時小時固定后處理：固定后處理： 流水沖洗流水沖洗12小時小時24小時小時配制方法：配制方法： 甲醛甲醛10ml + 生理鹽水生理鹽水/蒸溜水蒸溜水90ml特性：特性： 甲醛放置時間過長易產生白色沉淀甲醛放置時間過長易產生白色沉淀“三聚三聚甲醛甲醛”，氧化后變為甲酸，使溶液變為酸性，嚴重，氧化后

14、變為甲酸，使溶液變為酸性，嚴重時可影響到細胞核著色（時可影響到細胞核著色（）。）。乙醇乙醇(ethyl alcohol) 固定濃度：固定濃度： 80%-90%乙醇液乙醇液 固定時間：固定時間： 一般一般4小時小時12小時小時 固定后處理：固定后處理： 直接入脫水劑直接入脫水劑 配制方法：配制方法： 無水乙醇無水乙醇 + 蒸餾水蒸餾水 特性：特性： 乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時間過長時，易發脆。濃度乙醇中放置時間過長時，易發脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內脂肪、類脂體、以上濃度的乙醇可溶解組織內脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目

15、的色素等，注意制片的目的（） 。中性甲醛液中性甲醛液 配制方法：配制方法： 40%甲醛甲醛 120ml 蒸餾水蒸餾水 880ml 磷酸二氫鈉磷酸二氫鈉 4g 磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 13g固定時間：固定時間： 24小時小時固定后處理：固定后處理： 流水沖洗流水沖洗24小時小時適用組織：適用組織： 常用固定劑，適用廣泛常用固定劑，適用廣泛（）乙醇乙醇甲醛液（甲醛液（af液）液） 配制方法：配制方法： 95%乙醇乙醇90ml 40%甲醛甲醛10ml 固定時間：組織塊固定固定時間：組織塊固定412小時，小時， 鋪片固定鋪片固定 510分鐘。分鐘。 固定后處理：直接入脫水劑。固定后處理：直接入脫水劑。

16、適用組織：肥大細胞，糖原的固定適用組織：肥大細胞，糖原的固定（） 。 bouin氏液氏液配制方法：飽和苦味酸溶液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml 40%甲醛甲醛25ml 冰乙酸冰乙酸5ml固定時間：固定時間：1224h固定后處理：固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產生的黃色乙醇脫去苦味酸產生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。和胚胎組織。五、固定后處理五、固定后處理 除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產生的沉淀、除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產生的沉淀、結晶和色素的步驟稱為固定后處理。結晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下

17、六種方法：主要有以下六種方法：1. 流水沖洗流水沖洗 ：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經過流水：重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經過流水沖洗沖洗24h。2. 酒精脫黃酒精脫黃 : 含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經過過70乙醇洗滌脫去黃色。乙醇洗滌脫去黃色。 脫脫 水水一、定義一、定義 用某種能與透明劑互溶的化學試劑將組織內用某種能與透明劑互溶的化學試劑將組織內的水分逐漸置換出來的過程。的水分逐漸置換出來的過程。 要點：緩慢、徹底、勿過度。要點：緩慢、徹底、勿過度。二、常用二、常用脫水劑脫水劑 乙醇乙醇、丙酮、正丁醇丙酮、正丁醇 乙醇乙醇固定劑固定劑 + 脫水劑

18、脫水劑上行酒精脫水上行酒精脫水70%（30%）100%，以，以10遞增。遞增。丙酮丙酮脫水強，但對組織的收縮脆化作用也強；脫水強，但對組織的收縮脆化作用也強；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護某些特殊染色的標本不被褪色。某些特殊染色的標本不被褪色。 透透 明明一、定義一、定義 對組織的最后脫水處理。對組織的最后脫水處理。 在經過前一階段的在經過前一階段的“脫水脫水”后，還要借某種后，還要借某種有機溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋有機溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質相溶而浸滲。介質相溶而浸滲。二、常用透明劑二、常用透明

19、劑 二甲苯二甲苯、苯甲酸甲脂苯甲酸甲脂、三氯甲烷、三氯甲烷 、冬青油、冬青油 二甲苯二甲苯 為無色透明的液體，易揮發，長期接觸對呼吸道粘膜為無色透明的液體，易揮發，長期接觸對呼吸道粘膜有較強的刺激作用有較強的刺激作用20分鐘分鐘1個小時，大塊組織可適當延長時間。個小時，大塊組織可適當延長時間。作用迅速，浸泡時間過長易發生過度收縮和脆化作用迅速，浸泡時間過長易發生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發為無色透明的液體，易揮發透明作用較二甲苯緩慢，透明時間透明作用較二甲苯緩慢，透明時間12-24小時。小時。對組織塊的收縮和脆化的影響較小。對組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲

20、脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明 用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程用石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程 包括浸蠟和包埋兩步包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟一、浸蠟 組織透明后，用石蠟置換組織內部的透明劑的組織透明后，用石蠟置換組織內部的透明劑的過程稱為過程稱為浸蠟浸蠟。 組織塊浸蠟一般先經過低熔點蠟，再經過高熔組織塊浸蠟一般先經過低熔點蠟，再經過高熔點蠟。點蠟。 包包 埋埋 高溶點蠟也稱高溶點蠟也稱硬蠟硬蠟溶點在溶點在60-62硬蠟箱的溫度控制在硬蠟箱的溫度控制在62-64之間之間組織浸蠟時間一般不超過組織浸蠟時間一般不超過1小時小

21、時 低溶點蠟也稱低溶點蠟也稱軟蠟軟蠟溶點在溶點在48-50 軟蠟箱的溫度控制在軟蠟箱的溫度控制在5254之間之間 組織浸蠟時間一般可達組織浸蠟時間一般可達24小時小時二、包埋二、包埋 組織浸蠟完成后，接著進行組織塊包埋。組織浸蠟完成后，接著進行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。 修整蠟塊時，組織塊應距蠟塊邊緣修整蠟塊時，組織塊應距蠟塊邊緣23毫毫米，以利于連續切片。米，以利于連續切片。 切切 片片 石蠟切片石蠟切片 組織切片中應用最為廣泛的一種切片就是用組織切片中應用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄石蠟作為

22、包埋劑制作的切片。易于制作大量菲薄的組織標本，而且包埋塊可長期保存。的組織標本，而且包埋塊可長期保存。一、儀器及器材一、儀器及器材二、切片過程：二、切片過程： 調節恒溫水箱水溫至調節恒溫水箱水溫至47左右；左右； 固定蠟塊于固定器；固定蠟塊于固定器； 快修裝置修整包埋面；快修裝置修整包埋面； 調節切片厚度至調節切片厚度至46微米；微米； 連續切片；連續切片； 攤片于水箱內；攤片于水箱內； 將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上；將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上； 置于溫箱內烤片。置于溫箱內烤片。三、切片的注意事項三、切片的注意事項 切片前要將切片機各部位的螺絲旋緊，否則會切片前要將切片機各部位的螺絲旋緊

23、，否則會引起切片機各部件震動，造成切片厚薄不勻。引起切片機各部件震動，造成切片厚薄不勻。 包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應按切片機刀臺上的刻度作適當調整。按切片機刀臺上的刻度作適當調整。 恒溫水箱的溫度應比包埋蠟的溶點低恒溫水箱的溫度應比包埋蠟的溶點低5-6。染染 色色 一、一、染料染料 指分子中含有指分子中含有發色團發色團和和助色團助色團的有機化合物，有鮮的有機化合物，有鮮艷的色彩，對于組織有極強的親和力。艷的色彩，對于組織有極強的親和力。 根據根據來源來源可分為兩類：可分為兩類： 天然染料（卡紅、蘇木精）天然染料（卡紅、蘇木精） 人工合成染料

24、（苦味酸、桔黃人工合成染料（苦味酸、桔黃g） 根據其根據其化學性質化學性質分為：分為： 堿性染料堿性染料(basic dye) 酸性染料酸性染料(acid dye) 中性中性(neutrophilia)染料染料二、染色的原理二、染色的原理 染色染色就是染料和組織細胞的分子相互結合，使組織和就是染料和組織細胞的分子相互結合，使組織和細胞著色。細胞著色。 化學反應化學反應 在組織細胞內含有酸性物質和堿性物質。染在組織細胞內含有酸性物質和堿性物質。染色時酸性物質與堿性染料結合；堿性物質與酸性染料結合。色時酸性物質與堿性染料結合；堿性物質與酸性染料結合。細胞核中主要由酸性物質組成（如核酸等），所以與蘇

25、木細胞核中主要由酸性物質組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強的親和力。細胞質主要由堿性物質組精等堿性染料有很強的親和力。細胞質主要由堿性物質組成，所以與伊紅等酸性染料有很強的親和力。成，所以與伊紅等酸性染料有很強的親和力。 能被堿性染料著色的物質：嗜堿性能被堿性染料著色的物質：嗜堿性(basophilia)； 能被酸性染料著色的物質：嗜酸性能被酸性染料著色的物質：嗜酸性(acidophilia)。三、染色的注意事項：三、染色的注意事項：1.溶媒：水和乙醇。溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時間。濃度：低濃度，長時間。3. 溫度：高，染色效果明顯。溫度：高，染色效果明顯。4. 適當使

26、用媒染劑、促染劑和分化劑。適當使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑媒染劑：能增強染料對組織的著色能力，其本身與染料或組織能增強染料對組織的著色能力，其本身與染料或組織發生結合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時添加的鉀明礬、發生結合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時添加的鉀明礬、銨明礬等。銨明礬等。促染劑促染劑：能增強染料對組織的著色能力，本身并不參與染色反能增強染料對組織的著色能力，本身并不參與染色反應。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。應。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周圍組織對比鮮明，著色深淺適當；例如低濃度的鹽酸、醋酸周圍組織對比鮮明，著色深淺適當；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。封封 固固一、定義一