1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體的制備與鑒定(作者：單位：郵編：)【摘要】目的：制備抗人絨毛膜促性腺激素(HCG的單克隆 抗體(mAb)。方法：利用從人工流產刮宮物中提取的 HCG免疫BALB/c 小鼠，取其脾細胞同NS11小鼠骨髓瘤細胞融合，采用有限稀釋法 篩選雜交瘤細胞株，并對mAb的亞型、 親和力及特異性進行鑒定。 結果：共獲得26株能穩定分泌抗HCG特異性mAb的雜交瘤細胞株。mAb的亞類均為lgG1,親和力介于1.14 X 1082.0 X 108 mol/L之間, 其中4株mAb與HCG勺B亞基有較強的反應，而與黃體激素(LH)、促 卵泡激素(FS

2、H)、促甲狀腺激素(TSH)均無交叉反應。結論：成功獲 得4株鼠抗人HCGnAb的雜交瘤細胞株，其分泌的mAb能特異識別人 HCG勺B亞基，可用于早孕、腫瘤等診斷的進一步研究。【關鍵詞】人絨毛膜促性腺激素；雜交瘤細胞株；單克隆抗體人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, HCG) 是人類受孕后胎盤合體滋養層細胞分泌的維持正常妊娠必需的一種糖蛋白激素。HCG子含有兩個亞基，分別為a和B亞基。兩個亞基的分 子結構不同，以二硫鍵將兩個亞基連結在一起形成二聚體結構，HCG的生物學活性和免疫學特性由B亞基決定1。在妊娠早期HCG的濃度迅速增高，監測尿中的HCG!卩

3、可證實妊娠2。另外，HCG的含量 與許多異位HCG表達的腫瘤有密切關系，可將HCG看作是相關的腫瘤 標志物之一3,因此,HCG的檢查不僅對早孕檢測具有重要意義， 而且可對滋養層細胞腫瘤和非滋養層細胞腫瘤的診斷與鑒定提供依 據。抗HCG單克隆抗體(mAb)的研制，在早孕診斷、先兆流產的預測 以及腫瘤的診斷方面上具有十分重要的意義。1材料和方法1.1材料 人工流產刮宮物由鄭州某醫院提供。BALB/c小鼠由鄭州大學醫學院實驗動物中心引進。小鼠骨髓瘤細胞株NSK.1為本室保存。細胞培養板為CORNIN公司產品。酶標儀為 AUTOBIO010產品。 DME培養液為Gibco公司產品。血清購自上海維群公司

4、。HCGE型鑒 定試劑盒、 弗氏完全佐劑、 弗氏不完全佐劑、培養液添加劑HAT丙酮酸鈉、L擬谷氨酰銨、黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促 甲狀腺激素(TSH),均為Sigma公司產品。HCG 口擬HCG B擬HCG 購自USBIO HCG定量檢測試劑盒，購自上海天呈科技有限公司。1.2方法1.2.1 免疫用HCG勺制備 將人工流產刮宮物于4C、以4 000 r/min 離心30 min后，收集上清并向其中加入等量的 950 mL/L的冷乙醇， 攪拌過夜。次日，于4C ,以4 000 r/min離心30 min。收集上清，用 0.05 mol/L醋酸緩沖液溶解沉淀，然后重復第1步，合并兩

5、次所得 上清。向上清中加入950 mL/L的冷乙醇使之終濃度達到 80%,于4C 靜置過夜。次日，于4C、以4 000 r/min離心30 min,收集沉淀， 用0.05 mol/L醋酸緩沖液溶解沉淀，再重復1次抽提與沉淀過程。收集沉淀，溶解于生理鹽水中，用紫外分光光度計測定蛋白含量4, 5。取膨脹好的 DEAEX纖維素DE以52,經酸堿處理后，用0.02 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液充分平衡填裝 2 cmx 30 cm的層析柱。將在上述緩沖液中充分透析的 HCG 300 mg上柱，用3倍體積的緩沖 液淋洗。然后用含0.2 mol/L NaCl的上述緩沖液進行梯度洗脫。收 集蛋白峰，用H

6、CG!量檢測試劑盒測定HCG勺含量，合并含量較高的 組分，濃縮到1 g/L左右。用SDS；PAG盼析蛋白質的純度，并用紫 外分光光度計測得的蛋白含量和用試劑盒測得的HCG含量之比，估計產物的純度，過濾除菌后分裝，于-20 C保存。1.2.2 免疫動物 選擇68周齡的BALB/c小鼠，體質量約20 g,以 純化的HCG免疫，每次免疫劑量均為100卩g/只。首次免疫與等量 的弗氏完全佐劑充分乳化，第2次與第3次免疫與等量的弗氏不完全 佐劑充分乳化，均為腹腔注射，每次間隔1015 d,融合前3 d脾 臟加強免疫1次6。1.2.3雜交瘤細胞株的建立采用常規方法進行細胞融合，所用PEG 的相對分子質量（

7、Mr）為1 500。用間接ELISA篩選分泌抗HCG勺陽 性克隆，先用HCG鑒定，然后用游離的a和B亞單位進行區分。 雜交 瘤細胞的克隆化及腹水制備均按實驗室常規進行。1.2.4 mAb的特性鑒定 （1） Ig亞類的鑒定：采用亞類鑒定試劑盒 進行鑒定。（2）親和性測定：mAb腹水經倍比稀釋測定效價以后，采 用非競爭酶免實驗法測定。（3）特異性鑒定：按間接ELISA法，以HCG u擬HCG B擬HCG LH、FSH、TSH分別包被酶免板，檢 測所獲得mAb的交叉反應性。2 結果2.1雜交瘤細胞株的建立經篩選、克隆化共獲得可分泌抗HCGmAb 的雜交瘤細胞26株，其中針對u擬HCG勺10株，針對B

8、擬HCG勺4 株，針對HCG勺12株，見表1。將陽性克隆凍存于液氮中，每隔1 個月復蘇1次，用ELISA方法檢測復蘇后細胞培養上清的效價，結果 表明26株雜交瘤細胞經10次凍存復蘇和20代傳代均能夠比較穩定 的分泌mAb表1抗HCG mA的特異性鑒定（A490值）2.2 HCG的純化 純化前，人工流產刮宮物中HCG勺含量經HCG定量 檢測試劑盒測定約為100 IU/mL,純化產物經紫外分光光度計測定蛋 白總量為10 mg,用HCG定量檢測試劑盒測定約為2 500 IU/mL。經 SD$以PAG盼析純化的蛋白目的條帶 Mr 39區帶占總區帶的50%以上（圖 1）。2.3 mAb的特性鑒定（1）l

9、g 亞類：經試劑盒測定4株mAb亞類均為lgG1（2）親和力：4 株 mAb的親和力介于 1.14 X 1082.0 X 108 mol/L 之間。（3）特異性:4株與HCG B亞基有較強反應的雜交瘤細胞株培 養上清液與LH FSH、TSH無交叉反應；而與HCGu亞基有較強反 應的雜交瘤細胞株培養上清液與 LH FSH TSH有不同程度的交叉 反應（表1）。3討論抗體是構成機體免疫力的一類重要物質，也是醫學及獸醫學中用于 疾病診斷、治療、預防和研究發病機制的極為重要的常用試劑或制 劑。mAb因其結構相同、 成分均一、 特異性強、 生物學活性高等 特性，對抗原的生物學特性、抗原性研究，以及對與抗

10、原有關的疾病的診斷、 治療，以及免疫機制的研究等均具有重要意義。mAb制劑已成為生物醫學研究中用作檢測及治療的重要工具。我們通過從人工流產刮宮物提取 HCG，保證了其良好的免疫原性， 能夠確保抗體的親和力以及特異性，是一種較為有效的方法。HCG與 來自腦垂體的一些糖蛋白如 LH FSH和TSH等結構相似，a鏈的氨 基酸排列順序基本相同，而代表HCG特異性的僅是B鏈羧基末端約 30個氨基酸的片段，因此，得到與B亞基有較強反應的 mAb更有意 義。在實驗中我們得到了 4株抗B亞基的mAb,與HCG勺B亞基的反 應明顯，且與LH FSH TSH無交叉反應，具有較好的特異性和實 用性，為早孕、腫瘤的診

11、斷及計劃生育的進一步研究奠定了物質基 礎。但總體B亞基抗體獲得數較少，說明用整分子HCG乍為免疫原制 備針對HCGB亞基的mAb有定困難。是否可以通過真核表達人 HCG B亞基或將HCG B亞基與載體蛋白偶聯進行免疫來提咼針對 HCGB 亞基mAb的獲得率，還有待進一步研究。【參考文獻】:1鄭亦輝.動物激素及其應用M .南京：江蘇科學技術出版社,1996: 145-175.:2楊廷富.人絨毛膜促性腺激素的臨床意義及檢測進展J.檢驗醫學與臨床，2007, 4(10): 976-978.3 Acevedo HF, Tong JY, Hartsock RJ. Human chorionicgon adotrop in beta sub unit gene expressi on in culture huma nfetal andeancer cells of differenttypes and origin J . Cancer,1995, 76(8): 1467-1475.:4李立權，袁鴻錦，張鴻志，等.人工流產刮宮物中絨毛膜 促性腺激素的提取和純化J .獸醫大學學報,1991, 11(4):374-378.:5楊銀書，杜全木.人工流產物中的HCG勺分離與純化J.生物化學