1、會計學1 DNA測序技術及其應用測序技術及其應用PPT課件課件 引言引言 測序技術的應用與展望測序技術的應用與展望 第一代測序技術第一代測序技術 第二代測序技術第二代測序技術 第1頁/共64頁 第2頁/共64頁 人類基因組計劃（人類基因組計劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP） 于于19901990年正式啟動，其主要目標有：識別人類年正式啟動，其主要目標有：識別人類 DNADNA中所有基因（超過中所有基因（超過1010萬個）；測定組成人類萬個）；測定組成人類 DNADNA的的3030億堿基對的序列億堿基對的序列；將這些信息儲存到數；將

2、這些信息儲存到數 據庫中；開發出有關數據分析工具；致力于解據庫中；開發出有關數據分析工具；致力于解 決該計劃可能引發的倫理、法律和社會問題。決該計劃可能引發的倫理、法律和社會問題。 已于已于20032003年完成。年完成。 人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大 的科學工程，它奠定了的科學工程，它奠定了2121世紀生命科學發展和世紀生命科學發展和 現代醫藥生物技術產業化的基礎，具有科學上現代醫藥生物技術產業化的基礎，具有科學上 的巨大意義和商業上的巨大價值。的巨大意義和商業上的巨大價值。 第3頁/共64頁 測序技術最早可以追溯到測序技術最早可以追溯到20世紀世

3、紀50年代。年代。 早在早在1945年就已經出現了關于早期測序技術的年就已經出現了關于早期測序技術的 報導，即報導，即Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核等用化學降解的方法測定多聚核 糖核苷酸序列。糖核苷酸序列。19771977年年Sanger等發明的雙脫氧核苷等發明的雙脫氧核苷 酸末端終止法和酸末端終止法和Gilbert等發明的化學降解法，等發明的化學降解法，標志標志 著第一代測序技術的誕生著第一代測序技術的誕生。 此后在三十幾年的發展中陸續產生了第二代測此后在三十幾年的發展中陸續產生了第二代測 序技術，包括序技術，包括Roche公司的公司的454技術技術、Illumina公司公司

4、的的SolexaSolexa技術技術和和ABI公司的公司的SOLiD技術技術。 第4頁/共64頁 最近，最近，Helicos公司的單分子測序技術、公司的單分子測序技術、 Pacific Biosciences公司的單分子實時公司的單分子實時( (Single Molecule Real Time, SMRT) )測序技術和測序技術和 Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的公司正在研究的 納米孔單分子測序技術被認為是第三代測序技納米孔單分子測序技術被認為是第三代測序技 術。術。 測序技術正在向著高通量、低成本、長讀測序技術正在向著高通量、低成本、長讀 取長度的方向

5、發展。取長度的方向發展。 第5頁/共64頁 第6頁/共64頁 第7頁/共64頁 第8頁/共64頁 第9頁/共64頁 第10頁/共64頁 第11頁/共64頁 第12頁/共64頁 P OH dNTP ddNT P P OH OH P P P P O H 第13頁/共64頁 第14頁/共64頁 第15頁/共64頁 第16頁/共64頁 3730 全自動 測序儀 第17頁/共64頁 第18頁/共64頁 第19頁/共64頁 第一代測序技術在分子生物學研究中發第一代測序技術在分子生物學研究中發 揮過重要的作用揮過重要的作用, ,如人類基因組計劃如人類基因組計劃(human (human genome pro

6、ject,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA測測 序技術。目前基于熒光標記和序技術。目前基于熒光標記和SangerSanger的雙脫的雙脫 氧鏈終止法原理的氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀熒光自動測序儀仍被廣泛仍被廣泛 地應用。地應用。 第20頁/共64頁 第21頁/共64頁 基因組基因組DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA） 構建構建ssDNAssDNA文庫文庫 測序測序 （聚合酶合成測序聚合酶合成測序，連接酶合成測序連接酶合成測序） 由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應就能夠大規模平行由于所有的克隆都在同一平面上，這

7、些反應就能夠大規模平行 進行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，進行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行， 從而獲得測序數據。從而獲得測序數據。DNADNA序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經過計序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經過計 算機分析就可以獲得完整的算機分析就可以獲得完整的DNADNA序列信息。序列信息。 第22頁/共64頁 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、熒光熒光 素酶素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個的作用下，將每一個 的聚合與一次化學發光信號的釋放偶聯起來的聚合與一次化學發光信號的釋放偶聯起來 ，通過檢測化學發光信號的有無和強度，達，

8、通過檢測化學發光信號的有無和強度，達 到實時檢測到實時檢測序列的目的。序列的目的。 第23頁/共64頁 硫化酶硫化酶 熒光素酶熒光素酶 第24頁/共64頁 第25頁/共64頁 指示器指示器 相機相機 PTPPTP盒盒 第26頁/共64頁 454 454測序法的突出優勢是測序法的突出優勢是較長的讀長較長的讀長，目，目 前前GS FLXGS FLX測序系統的序列讀長已超過測序系統的序列讀長已超過400 bp400 bp。 雖然雖然454454平臺的測序成本比其他新一代測序平平臺的測序成本比其他新一代測序平 臺要高很多，但對于那些需要長讀長的應用，臺要高很多，但對于那些需要長讀長的應用， 如從頭測序

9、，它仍是最理想的選擇。如從頭測序，它仍是最理想的選擇。 缺點是缺點是無法準確測量同聚物的長度無法準確測量同聚物的長度。 第27頁/共64頁 Illumina公司的新一代測序儀公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由最早由 Solexa公司研發，利用合成測序公司研發，利用合成測序( (Sequencingby Synthesis) ) 的原理，實現自動化樣本制備及大規模平行測序。的原理，實現自動化樣本制備及大規模平行測序。 原理：原理： 將基因組將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻的隨機片段附著到光學透明的玻 璃表面（即璃表面（即Flow cell），這些），這些DNA片段經

10、過延伸和片段經過延伸和 橋式擴增后，在橋式擴增后，在Flow cell上形成了數以億上形成了數以億Cluster， 每個每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然是具有數千份相同模板的單分子簇。然 后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通 過可逆性終止的過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測（邊合成邊測序）技術對待測 的模板的模板DNA進行測序。進行測序。 第28頁/共64頁 第29頁/共64頁 第30頁/共64頁 第31頁/共64頁 GenomeAnalyzer系統需要的系統需要的樣品量低至樣品量低至 100ng，文庫構建過程

11、簡單，減少了樣品分離，文庫構建過程簡單，減少了樣品分離 和制備的時間，配對末端讀長可達到和制備的時間，配對末端讀長可達到250bp， 每次運行后可獲得超過每次運行后可獲得超過20 GB的高質量過濾數的高質量過濾數 據，且運行成本較低，是性價比較高的新一代據，且運行成本較低，是性價比較高的新一代 測序技術。測序技術。 第32頁/共64頁 SOLID通過連接反應進行測序。其基本原理通過連接反應進行測序。其基本原理 是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成， 取代傳統的聚合酶連接反應。具體步驟包括：取代傳統的聚合酶連接反應。具體步驟包括： 文庫準備文庫準

12、備 擴增擴增 微珠與玻片連接微珠與玻片連接 連接測序連接測序 第33頁/共64頁 第34頁/共64頁 第35頁/共64頁 第36頁/共64頁 超高通量超高通量是是SOLID系統最突出的特系統最突出的特 點，目前點，目前SOLID 3單次運行可產生單次運行可產生50 GB 的序列數據，相當于的序列數據，相當于17倍人類基因組覆倍人類基因組覆 蓋度。蓋度。 第37頁/共64頁 第38頁/共64頁 第二代的高通量測序技術已經得到了很好的發第二代的高通量測序技術已經得到了很好的發 展和應用展和應用, , 但是由于其但是由于其測序速度、成本、準確度測序速度、成本、準確度等等 關鍵問題的解決仍存在困難關鍵

13、問題的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光研究者們很快將目光 轉向了更高更新的測序解決方案。轉向了更高更新的測序解決方案。 單分子測序也單分子測序也 就應運而生。就應運而生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成立中科院北京基因組研究所與浪潮成立 “中科院北京基因組研究所中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學聯合浪潮基因組科學聯合 實驗室實驗室” 第39頁/共64頁 三代測序技術是以三代測序技術是以單分子測序單分子測序為特點的測序技術為特點的測序技術 v 單分子即時單分子即時DNA測測序技術序技術( (SMRT) ) v HeliScope單分子測序單分子測序

14、v 基于熒光共振能量轉移的即時基于熒光共振能量轉移的即時DNA測序測序 v 納米孔單分子測序技術納米孔單分子測序技術 第40頁/共64頁 第三代測序技術第三代測序技術 1 1、目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp/ s3bp/ s 2 2、它實現了、它實現了DNADNA聚合酶內在自身的聚合酶內在自身的processivity （延續性，也就是（延續性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很聚合酶一次可以合成很 長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。 3 3、它的精度非常高，達到、它的精度非常高，達到99.9999%99.9999%。 第4

15、1頁/共64頁 標記熒光基因標記熒光基因 DNA聚合酶作用 顯微鏡下進行熒光探測顯微鏡下進行熒光探測 零級波導的納米結構零級波導的納米結構來實來實 現即時觀察和背景熒光干現即時觀察和背景熒光干 擾擾 第42頁/共64頁 D N A 聚 合 酶 第43頁/共64頁 優點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監測系統，能夠直接記優點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監測系統，能夠直接記 錄到錄到單個堿基單個堿基的熒光，從而克服了第二代測序必須用的熒光，從而克服了第二代測序必須用PCRPCR擴增出數千個拷貝擴增出數千個拷貝 以增加信號亮度的缺陷。以增加信號亮度的缺陷。 DNADNA 聚聚 合合

16、酶酶 熒光標熒光標 記的記的 dNTPdNTP 產生熒光產生熒光 CCD記錄記錄 發生了堿基延伸反應發生了堿基延伸反應 平面基板模擬圖平面基板模擬圖 第44頁/共64頁 能量 第45頁/共64頁 DNADNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔, , 利用核酸外切酶的特性來識別出不同的利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNADNA堿基堿基 優點：納米孔測序的優勢在于它不需要對優點：納米孔測序的優勢在于它不需要對DNADNA進行標記進行標記 ，也就省去了昂貴的熒光試劑和，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCDCCD照相機。照相機。 內部：核酸外切酶和環式糊精

17、 由生物分子組成的納米孔由生物分子組成的納米孔 第46頁/共64頁 第47頁/共64頁 第48頁/共64頁 第49頁/共64頁 第50頁/共64頁 完成全基因組測序的部分的物種完成全基因組測序的部分的物種 第51頁/共64頁 第52頁/共64頁 第53頁/共64頁 轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某 一功能狀態下所能轉錄出來的所有一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNARNA的總的總 和，包括和，包括mRNAmRNA和非編碼和非編碼RNARNA。轉錄組測序是。轉錄組測序是 指用新一代高通量測序技術對物種或者組織指用新一代高通量測序技術對物種或者組織 的轉錄本進行測序并得到相關的轉錄本信息的轉錄本進行測序并得到相關的轉錄本信息 。 第54頁/共64頁 第55頁/共64頁 第56頁/共64頁 第57頁/共64頁 第58頁/共64頁 第59頁/共64頁 第60頁/共64頁 利用光學成像技術設計的新型利用光學成像技術設計的新型DNADNA測序簡圖測序簡圖 第61頁/共64頁 原理：當光照在一個物體上時，物體離光源越近，原理：當光照在一個物體上時，物體離光源越近， 離成像面越