1、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基精品文檔寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求， NEB采用了一系 列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙 酶切順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn) 靠近 DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端 至少加上 6 個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用 - 32PATP在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記 0.1A260

2、單位的寡 核苷酸。取 1 g已標(biāo)記了的寡核苷酸與 20 單位的內(nèi)切酶，在 20C條件下分 別反應(yīng) 2 小時(shí)和 20 小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及適量的 NaCl 或 KCl（視酶的具體要求而定）。 20%的 PAGE （7 M 尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對(duì)照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率 則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。DNA 合成，新鏈的延伸方向是 53 因此，需要在 5 端加上酶切位點(diǎn) ,因?yàn)閮?nèi)切 酶除了有特異的識(shí)別位點(diǎn)之外，還需多幾個(gè)無需特異性的

3、堿基提供一個(gè) platform 讓它可以結(jié)合上去，否則會(huì)掉下來 . 引物的結(jié)構(gòu)就是（ 5 3）：保護(hù) 堿基 + 酶切位點(diǎn) + 原來的引物序列收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除精品文檔首先要看目的基因中是否含有該酶切位點(diǎn)，只有沒有的才可以選 （ 小蝦米酶切位 點(diǎn)分析 ） 。其次，如果需要做表達(dá)，需要考慮起始密碼子，防止移碼突變酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CC ACATGT GG109090CCC ACATGT GGG129090Asc IG

4、GCGCGCC89090AGGCGCGCC T109090TTGGCGCGCC AA129090Ava ICCCCGGG G85090CC CCCGGG GG109090TCC CCCGGG GGA129090BamH ICGGATCC G81025CG GGATCC CG109090CGC GGATCC GCG129090Bgl IICAGATCT G800GAAGATCT TC107590GGA AGATCT TCC122590BssH IIG GCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA125090BstE IIG GGT(A/T)ACC C9010

5、BstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT272590Cla ICATCGAT G800G ATCGAT C800CC ATCGAT GG109090CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C89090CG GAATTC CG109090CCG GAATTC CGG129090Hae IIIGG GGCC CC89090AGC GGCC GCT109090TTGC GGCC GCAA129090Hind IIICAAGCT

6、T G800CC AAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除精品文檔Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC109090CGG GGTACC CCG129090Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550Nco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGTTT CATATG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC207590GGGA

7、ATTC CATATG GAATTCCC227590Nhe IGGCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050Not ITTGCGGCCGC AA1200ATTT GCGGCCGC TTTA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA282590Nsi ITGC ATGCAT GCA121090CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT229090Pac ITTAATTAA800GTTAAT

8、TAA C10025CC TTAATTAA GG12090Pme IGTTTAAAC800GGTTTAAAC C10025GG GTTTAAAC CC12050AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG247590Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AA CTGCAG AACCAATGCATTGG229090AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA249090CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600Pvu ICCGATCG G800ATCGATCG AT101025TCG CGATCG CGA12010Sac

9、 ICGAGCTC G81010Sac IIG CCGCGG C800TCC CCGCGG GGA125090Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系管理員刪除精品文檔Sca IG AGTACT C81025AAA AGTACT TTT127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CC CCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA129090S

10、pe IG ACTAGT C81090GG ACTAGT CC101090CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050Sph IGGCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T89090GA AGGCCT TC109090AAA AGGCCT TTT129090Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC109090TGC TCTAGA GCA127590CTAG TCTAGA CTAG147590Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CC CCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG125090TCCC CCCGGG