1、生 物 工 程 學 報崔金玉等/甲烷氧化菌20z利用embden-meyerhof-parnas途徑高效同化甲烷，43chinese journal of biotechnology/cjbcnjanuary 25, 2014, 30(1): 43- 54doi: 10.13345/j.cjb.130375?2014 chin j biotech, all rights reserved細胞工廠與發酵工程甲烷氧化菌20z禾ij用embden-meyerhof-parnas 途徑 高效同化甲烷崔金玉1,姚陸1,孫效樂2, marina g. kaly

2、uzhnaja楊松1,41青島農業大學生命科學學院山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島2661092山東省農業科學院質量標準與檢測試驗研究所，山東 濟南2501003美國華盛頓大學微生物系，華盛頓州西雅圖981054天津大學系統生物工程教育部重點實驗室，天津300072崔金玉，姚陸，孫效樂，等.甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途徑高效同化甲烷 .生物工程學報，2014, 30(1): 43 - 54.cui jy, yao l, sun xl, et al.highly efficient methane assimilation through embde

3、n-meyerhof-parnas pathway inmethylomicrobium alcaliphilum 20z. chin j biotech, 2014, 30(1): 43- 54.摘要：為了探究 丫變形菌綱(gammaproteobacteria) 甲烷氧化菌 methylomicrobium alcaliphilum 20z 的甲烷 同化代謝過程。文中整合rna-seq、lc-ms技術并結合13c標記策略對核酮糖單磷酸途徑(ribulose monophosphate pathway) 及下 游途徑展開系統組學分析。m. alcaliphilum 20z 代 謝物組定量分析

4、表明 entner-doudoroff (edd) 途徑的中間代謝物 6-磷酸葡萄糖的濃度是 (150.95 28.75)心磯山酮-3-脫氧-6-磷酸 葡糖酸濃度低于質譜定量分析檢測限，而 embden-meyerhof-parnas (emp) 途徑中果糖1,6-二磷酸、甘油醛-3- 磷酸/二羥丙酮磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的濃度分別是(1 142.02 士 302.88)、(1 m66176士 388.55) 穗 mol/l(3 067.57 898.13) mofuli edd和emp途徑的代謝物13c同位素動態富集研究，進一步揭示3位標記丙酮酸豐度是1位標記丙酮酸豐度的 46倍。最后，基因

5、表達比較分析發現emp途徑的關鍵基因(如：fbaa、tpia、gap和pyka)的表達水平(rpkm) 分別是2 479.2、2 493.9、2 274.6和1 846.0,而edd途徑中基因 (如： pgi、eda 和 edd)的 rpkm 僅是 263.8、341.2 和 225.4。綜合上述結果闡明emp 途徑才是 m. alcaliphilum 20z進行甲烷同化的關鍵通路。emp途徑代謝功能的全新iw述不但改變對gammaproteobacteria甲烷氧化菌甲烷同化模式的傳統認知，而且為甲烷高效生物催化轉化提供重要的理論基礎。關鍵詞：甲烷氧化菌，甲烷同化途徑，甲烷生物催化，13c標

6、記代謝物組，轉錄物組received : july 24, 2013; accepted : october 8, 2013supported by : the usa department of energy (no. de-sc0005154), open funding project of the key laboratory of systems bioengineering, ministry of education of china, and start-up funding of high-level talent at qingdao agricultural univer

7、sity (no. 1312). corresponding author : song yang. tel/fax: +86-532-88030327; e-mail: 美國能源部基金(no. de-sc0005154),中國系統生物工程教育部重點實驗室開放課題基金，青島農業大學高層次人才啟動基金(no. 1312)資助。網絡出版時間： 2013-11-27網絡出版地址：http:/kcms/detail/11.1998.q20131127.1120.005.htmlissn 1000-3061cn 11-1998/q chi

8、n j biotech january 25, 2014 vol.30 no.1highly efficient methane assimilation through embden-meyerhof-parnas pathway in methylomicrobium alcaliphilum 20zjinyu cui 1, lu yao1, xiaole sun2, marina g. kalyuzhnaya 3, and song yang1,41 shangdong province key laboratory of applied mycology , school of lif

9、e sciences, qingdao agricultural university , qingdao 266109, shandong, china2 institute of quality standards and testing , shandong academy of agricultural sciences , jinan 250100, shandong, china3 department of microbiology , university of washington , seattle, wa 98105, usa4 key laboratory of sys

10、tems bioengineering , ministry of education , tianjin university , tianjin 300072, chinaabstract: in order to understand metabolic functions essential for methane assimilation, we investigate dribulose monophosphate pathway and adjacent pathways in gammaproteobacterial methylomicrobium alcaliphilum

11、20z by using combined approaches of rna-seq, lc-ms, and 13c-labeled techniques. the absolute quantification of metabolome showed that the concentrations of intermediates, such as glucose-6-phosphate and 2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate, involved in entner-doudoroff (edd) pathway were (150.95+ 28.7

12、5) g mol/l and below the limit of detection of massspectrometry. in contrast, fructose-1,6-bisphosphate, glyceraldehyde-3-phosphate/dihydroxyacetone and phosphoenolpyruvate in embden-meyerhof-parnas (emp) pathway hadsignificantly higher concentrations with(1 142.02 + 302.88) g mol/l, (1 866.76+ 388.

13、55) g mol/l and (3 067.57+ 898.13) g mol/l, respectively. 13c-labelingexperiment further indicated that the enrichment of 3-13c1-pyruvate involved in emp pathway was 46 fold higher than1,13c1-pyruvate in edd pathway in a dynamic course. moreover, gene expression profile showed that the expression le

14、vels of genes in emp pathway (e.g. fbaa, tpia, gap and pyka) were 2 479.2, 2 493.9, 2 274.6 and 1 846.0, respectively, but gene expressionlevels in edd pathway (e.g. pgi, eda and edd) were only 263.8, 341.2 and 225.4, respectively. overall our current results demonstrated that emp pathway was the ma

15、in route for methane assimilation in m. alcaliphilum 20z.this discovery challenged our understanding of methane assimilation pathway in gammaproteobacterial methanotrophic bacteria, and further provided an important insight for efficient methane biocatalysis in the future.keywords : methanotrophs, m

16、ethane assimilation, methane biocatalysis, 13c-labeling metabolomics, transcriptomics/cjbcn甲烷(ch 4)是驅動全球氣候變暖的重要溫 室氣體，同時甲烷作為天然氣和沼氣的主要成 分不但是高價值燃料資源，也是一碳化工的重 要前體原料1-2。近年來，探討如何有效實現甲 烷催化轉變成化學產品成為國內外化工領域關 注的熱點課題之一 3-4。甲烷氧化菌是迄今為止 發現的唯一能以甲烷作為生長碳源和能源的生 物體。gammaproteobacteria 甲烷氧化菌利用核酮

17、糖單磷酸途徑(ribulose monophosphate pathway , rump)同化代謝甲烷， 是實現甲烷高 效生物催化轉化的最有前景微生物系5-6。然而除了單細胞蛋白和聚伊羥基丁酸 (poly- 3-hydroxybutyrrate) 7-8,目前基于甲烷的 生物催化轉化合成高附加值產品的成功研究還 沒有報道過。其中一個主要原因是甲烷氧化菌 基因組和后基因組的信息缺少、代謝網絡信息 崔金玉 等/甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途徑高效同化甲烷49不完整，阻礙對甲烷氧化菌合理而有效的代謝 工程改造。甲烷氧化菌 methylomicrobium al

18、caliphilum 20z是一株代表性的中性嗜鹽、嗜堿 gammaproteobacteria菌，其生長速率較快且穩9-10定，是具有廣泛應用前景的甲烷催化系統。2011年，m. alcaliphilum 20z基因組測序詮釋獲 得完成，為進一步從系統水平上闡明 m. alcaliphilum 20z的基因組功能、代謝網絡調 控機制及代謝工程改造奠定重要的理論基礎11。傳統生物化學和酶學研究一直認為 gammaproteobacteria 甲烷氧化菌主要利用 rump 途徑的 entner-doudoroff pathway (edd) 分支途徑進行甲烷氧化產物甲醛的同化吸收， 而另一途徑

19、embden-meyerhof-parnas (emp)是 旁支代謝路徑。然而，最近基因組分析顯示所 有參與 emp 途徑代謝反應的基因都在 m. alcaliphilum 20z 基因組中存在11。而且對 gammaproteobacteria 嗜 甲烷菌 methylococcus capsulatus bath蛋白物組分析也表明edd途徑和emp途徑的催化酶在 m. capsulatus bath中適 量表達12?？紤]到rump途徑中的emp途徑比 edd途徑能更高效吸收利用甲烷13,深入探究emp途徑在gammaproteobacteria甲烷氧化菌中 真正的代謝功能，就成為理解甲烷同

20、化吸收過 程和實現甲烷高效生物轉化的關鍵所在。本研究以闡述 m. alcaliphilum 20z 的中心代謝網絡特征為核心，利用 rna-seq、lc-ms 13 技術并結合c標記策略，深入探討細胞的轉錄物和代謝物兩個層次特征，揭示m. alcaliphilum20z中emp途徑是參與甲烷同化的重要代謝過 程。本研究結果對代謝工程改造 gammaproteobacteria 甲烷氧化菌高效轉化甲烷 合成高附加值產品具有十分重要的科學意義。1材料與方法1.1 菌種甲基營 養桿菌 methylotrophic extorquens am1 和 methylomicrobium alcaliphi

21、lum 20z 由美 國華盛頓大學 mary e.lidstrom課題組贈送。1.2 試劑氨基酸、有機酸和糖磷酸等12c-標記標準品是分析級，購買于 sigma公司(st. louis, mo, usa)。乙醇從 emd chemicals 公司購買 (gibbstown, nj, usa)。液相色譜使用是lc-ms級溶劑(fisher scientific, fair lawn, nj, usa) 。 超純水由 millipore q reference 制備。13c標記 甲醇(99%) 和13c標記甲烷分別購買于 cambridge isotope laboratories 公司 (and

22、over, ma, usa)和 sigma 公司。1.3 methylotrophic extorquens am1 和 methylomicrobium alcaliphilum 20z 的培養 1.3.1 m. extorquens am1 分批培養和以 13c 標 記甲醇為碳源的連續恒化培養m. extorquens am1 在 250 ml 錐形瓶中進 行液體分批培養，甲醇作為碳源，卡那霉素濃 度是50聞/ml ,培養溫度28 c ,具體培養方法 參見文獻14。n. extorquens am1 在 1 l 發酵罐 (bioflo110 , new brunswick scientif

23、ic, edison, nj, usa)中連續恒化培養。連續培養的無機鹽組分 與分批培養相同，25 mmol/l 13c標記甲醇作為碳 源。培養過程中，為除去空氣中的co2,將壓縮空氣通過 3個串聯的內含有 1 l koh (4 mol/l) 溶液的錐形瓶。恒化培養稀釋率 d= 0.1 h , od600=1.0 0,15個培養周期后收集細胞。 1.3.2 m. alcaliphilum 20z 的培養o. alcaliphilum 20z培養在改良 nms培養10基上 ,含有 3% nacl , 0.25g kno 3, ph 為 8.9, 甲烷濃度是 35% (v/v),搖床轉速是 250

24、 r/min , 培養溫度是30 c ,氣相色譜火焰離子化檢測器 檢測甲烷消耗濃度。1.4代謝物組的制備1.4.1 13c標記內標代謝物的制備10 ml 13c 標記 m. extorquens am1 細胞培養 液小心、快速轉移至28 ml冷浸液中(hepes(70 mmol/l, ph 6.8), 60% 甲醇 (v/v)溶液，-40 ),低溫冷凍離心(dupont sorvall rc5b, waltham, ma, usa),棄去上清液，沉淀細胞顆粒 重新溶解于同樣的冷浸溶液中，并在10 000 r/min下再次離心6 min ,接著提取13c標記內標代謝 物。提取核甘酸、有機酸、氨基

25、酸和糖磷酸的 方法參見文獻15。對于?；o酶，使用文獻15 中的酸提取方法。將所有13c標記的細胞提取物合并、稀釋和分裝在 -80下貯存，待用。1.4.2 m. alcaliphilum 20z代謝物組的樣品制備6 ml ( od600 =0.4 0.2)的細胞，按照上述方 法進行冷浸，接著在提取代謝物組前，將 905 的13c標記內標代謝物快速添加到細胞中，代謝物組提取方法參考文獻15,所獲樣品溶解在100 l的超純水中待分析。1.5 lc-ms分析代謝物組lc-ms 是在 waters (milford, ma, usa) 系 統上進行。lc-ms系統由1525科的高效液相色 譜泵、277

26、7c自動進樣器及quattro micro api質譜儀(micromass, manchester, uk) 組成。液相 色譜分離采用hilic模式，色譜柱是 luna nh 2(250 mm x 2 mm, 5 pm, phenomenex),具體方法 參見文獻16,質譜掃描模式是多反應監測 (mrm)。代謝物峰用 masslynx quanlynx applications manager (version 4.1) 軟 件進行分析。1.6 標準曲線的建立4山不同濃度的12c標記標準品添加到已 制備好的36山13c標記內標代謝物中，最終12c標記標準品的濃度分別是200、500、1 00

27、0、2 500、5 000、10 000、25 000、50 000 nmol/l 。以 12c 標準品峰面積和13c標記內標代謝物峰面積的一12比值作為縱坐標，以 c標準品濃度作為橫坐 標，構建標準曲線，進而計算擬合方程和r2,具體方法參見文獻15。1.7 13c標記動態代謝物組分析m. alcaliphilum 20z 在指數生長中期 (od600 =0.25 0.05)轉移到新培養瓶中，并快速 13 添加相應濃度ch4 (純度是99.9%),樣品在時間點(0、1、3、5、10、20、40 min)進行收集、 提取和保存，具體方法參見1.4。1.8 轉錄物組分析45 ml m. alcal

28、iphilum 20z 培養液 (od600 =0.30 0.05)添加到 5 ml 停止液 (含 5% 苯酚)中，總rna/dna 的提取方法參考文獻 17 , rneasy mini kit 和 microexpress kit 用 來純化 rna和富集 mrna , 1%瓊脂糖凝膠電 泳和 agilent 2100 bioanalyzer 分析提取的 rna 質量。rna-seq在美國華盛頓大學基因組測序 中心完成，測序平臺為illumina高通量深度測序。測序讀段(reads)利用 burrows-wheeler transform 算法和 m. alcaliphilum 20z 參考

29、基因 組比對和定位。利用 cufflinks軟件計算在基因 組上定位讀段的數量即 rpkm (reads per kilobase of gene per million mapped reads) , rpkm是每百萬讀段中來自某一基因每千堿基 長度的讀段數目。9rpkm=基因壓讀段計數x 10/（基因長度 x測序深度），具體分析方法參見文獻17。2結果與分析2.1 m. alcaliphilum 20z 中心代謝網絡的代 謝物濃度定量代謝物濃度影響代謝反應的方向和代謝反應的速率，因此準確定量代謝物是解析 m. alcaliphilum 20z代謝網絡特征白重要元素，是和其他微生物系進行比較

30、分析的基礎。由于 代謝物組樣品成分復雜，代謝物在質譜離子源 離子化過程中存在顯著差異性，并且離子間存在抑制效應，因此13c標記內標彳t謝物（13c-is）的添加是矯正質譜分析和樣品制備過程中出現 誤差的重要方法15。然而商業化13c-is稀缺且價格昂貴，本研究首先利用甲基營養菌 m. extorquens am1生物合成 13c-is ,進而將合 13成的 c-is添加到 m. alcaliphilum 20z的代謝物 提取液中，以提高m. alcaliphilum 20z胞內代謝 物濃度定量的準確性。選擇m. extorquens am1菌合成13c-is是因為其代謝物組成分及代謝網 絡 結

31、構 和 m. alcaliphilum 20z 相似，而且 m. extorquens am1生長更快速。圖 1顯示m. alcaliphilum 20z代謝物組絕對定量流程。air l2c standards mixture0.21510 50nmul/lykoh財，alcaliphilum 20z grcwn 廿am iderived l1c i.s.+i2c13crc圖1甲烷氧化菌 m. alcaliphilum 20z的代謝物組絕對定量流程fig. 1 workflow of absolute quantitation of etabolome inm

32、. alcaliphilum 20z. a: bioreactor cultivation ofm. extorquens am1 grown on 13c-methanol to obtain 13c-is; b: the development ofcalibration curve on lc-ms; c: the measurement of intracellular pool of m. alcaliphilum 20z based on m. extorquens am1 derived 13c-is.issn 1000-3061cn 11-1998/q chin j biote

33、ch january 25, 2014 vol.30 no.1表 1 是 m. alcaliphilum 20z 的 24 個中心代 methylosinus trichosporium ob3b 的中心代謝物 謝物濃度的定量結果。與我們前期研究報道%濃度相比較18,絲氨酸循環途徑(serine cycle)的變形菌綱 (alphaproteobacteria)甲烷氧化菌中間代謝物，如甘氨酸(glycine)、絲氨酸(serine)表1 m. alcaliphilum 20z和m. trichosporium ob3b胞內中間代謝物濃度的比較分析 table 1 comparison of i

34、ntracellular pool of key metabolites betweenm. alcaliphilum 20z andm. trichosporium ob3bm. alcaliphilum 20z m. trichosporium ob3bmetaboliteconcentration ( gol/l)ribulose-5-phosphate/ribose-5-phosphate859.0+201.7140.6 57.1fructose-1,6-bisphosphate1 142.0 墳2.9136.4 37.6fructose-6-phosphate/glucose-6-p

35、hosphate4 297.8 i352.22 836.0 654.3glyceraldehyde-3-phosphate/dihydroxyacetone1 866.8 i388.61 968.6 509.6phosphoglycerate4 050.8 與99.5811.9 118.3phosphoenolpyruvate3 067.6 i898.1661.5 103.4pyruvate4 607.5 1 304.31 134.7 +299.36-phosphogluconic acid151.0 立8.8n/ab2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconatetrac

36、ean/a bacetyl-coa291.2 毛7.4519.3 162.9succinate770.9 +232.81 304.4 323.9malate1 832.6 珈3.4950.2 154.7fumarate190.1 0.0400.5 85.7citrate917.0+227.63 149.2 528.1alanine2 927.2 均55.64 495.5 +766.2glycerate454.8 g3365.4 劃1.8glycine5 025.5 1 002.14 631.9 +484.1serine1 001.7 91.51 504.9 +142.0aspartate11

37、503.2 937.61 998.0 +481.7glutamate18 907.4 立 945.724 034.1 劃 060.4glutamine7 834.7 1 521.59 864.0 立 457.3a: metabolite concentration is below 10gol/l; b: not available./cjbcn崔金玉 等/甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途徑高效同化甲烷57和甘油酸(glycerate)的濃度沒有顯著變化。在三 竣酸(tricarxylic acid cycle

38、 , tca)循環途徑中， 由草酰乙酸 (oxalaceticacid , oaa)合成游離氨 基酸天冬氨酸(aspartate),在 m. alcaliphilum 20z中天冬氨酸的濃度是m. trichosporium ob3b的5.8倍，該結果與m. alcaliphilum 20z在高鹽環境下生長積累的四氫甲基喀咤竣酸關聯10。在 m. alcaliphilum 20z 中，果糖 1, 6-二磷酸 (fructose-1,6-bisphosphate , fbp)、核酮糖 5-磷 酸(ribulose 5-phosphate , ru5p)、磷酸烯醇式 丙酮酸(phosphoenol

39、pyruvate, pep) 濃度分別 是 m. trichosporium ob3b 的 8.4 倍、6.1 倍和 2.7 倍，該結果與rump途徑是m. alcaliphilum 20z進行甲烷同化吸收的主要代謝途徑的觀點相一致。此夕卜，近來在 m. extorquens am1 和 m. trichosporium ob3b 中分別發現新穎的乙醛 酸回補途徑(ethylmalonyl-coa pathway , emc 途彳仝)的存在18 19 ,然而在 m. alcaliphilum 20z 中未能檢測到emc途徑的關鍵中間代謝物 (如：甲基琥珀酸 (methylsuccinic ac

40、id) 和3-羥 丁酰-coa (3-hydroxybutyryl-coa),該結果表明正常培養條件下，emc途徑在m. alcaliphilum20z中沒有功能性激活。傳統研究認為 edd途徑是 rump途徑的主 要分支途徑同化吸收甲烷氧化產物甲醛，而 emp途徑僅是旁支途徑5。然而，代謝物組定量 分析卻發現了相反結果。由表 1可知，edd途 徑的關鍵中間代謝物6pg和kdpg 濃度很低(其中 6pg 濃度是(150.95 28.75) mol/l, kdpg濃度低于10科mol/4能準確定量)oemp 途徑的關鍵中間代謝物濃度明顯高于edd途徑的，其中 fbp 濃度是(1 142.02 3

41、02.88) mol/l, gap/dhap 是(1 866.76 388.55) 科 moep 是(3 067.57 898.13) 科mog過比較分析兩個分 支代謝途徑的中間代謝物濃度，我們可以推測 emp途徑很可能在甲烷同化吸收過程中起到更 重要的作用。2.2 edd和em p途徑中間代謝物的13c同位 素富集分析由圖2可見，在1 min時，果糖-6-磷酸/葡 萄糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate/glucose-6- phosphate, f6p/g6p)已經明顯獲得 1個碳的13c 富集，這表明甲烷快速通過核酮糖 5-磷酸(ru5p) 和甲醛的反應被吸收進入下游代

42、謝途徑。 1個碳 標記的f6p/g6p隨著時序延長而相對豐度逐漸 減少，而多碳標記的f6p/g6p相對豐度逐漸增加，這是由于磷酸戊糖途徑的碳重排反應(圖3a)。emp途徑下游中間代謝物(如：2-磷酸葡萄糖 /3-磷酸葡萄糖(glucose-2-phosphate/ glucose-3-phosphate, 2pg/3pg)和 pep)也同樣 地快速獲得1碳、2碳和3碳的13c富集，而且 2pg/3pg和pep在40 min時的總13c富集豐度 分別是54.9%和46.1%,這表明13c代謝流顯著 地通過emp途徑。由于6pg和kdpg濃度極低， 不能清楚卞測到13c富集。pyruvate是兩個

43、分支途徑的共同終點代謝 物，如果13c標記甲醛主要通過emp途徑同化吸收，將生成 1個碳標記 pyr在第3位(即 3-13c1-pyr),相反通過edd途徑將生成1個碳 標記pyr在第1位(即1,13c1-pyr)(圖3a)。我 們利用lc-ms/ms 分析1個碳標記 pyr的位置， 發現在13c富集過程中，3-13c1-pyr的豐度高于 1,13c1-pyr的約4-6倍(圖3b)。該結果清楚表 明emp途徑實際上是更重要分支途徑來進行甲 烷的吸收代謝。此外，我們也檢測了絲氨酸循環途徑的中間代謝物serine和glycine的 c富集規律，serine和 glycine在0- 40 min中1

44、3c富集豐度明顯偏低（圖2）。2.3 edd和emp途徑基因表達水平的比較 分析為了進一步驗證代謝物組和13c同位素動態富集研究的結論，我們比較分析了edd和emp途徑相關基因的表達水平。由表2可見，在edd途徑中，參與催化反應的基因，例如基因 pgi、eda和edd的表達豐度（即rpkm）分別是 263.8、341.2和225.4。反之，emp途徑的基因 有明顯更高的表達水平，例如基因fbaa、tpia、gap 和 pyka 的 rpkm 分別是 2 479.2、2 493.9、 2 274.6和1 846.0。因此整合轉錄物豐度、代謝 13物組濃度和 c標記分析的結果，我們認為emp 途徑

45、，而不是 edd途徑才是 m. alcaliphilum 20z 進行甲烷同化吸收的主要代謝通路（圖4）。pyruvatet (mm)f6pmm pm-h)rvi-i-zm+3親)?=a3一合)3uu曰 punq 4 uije-vht (min)一 一 一十0 0 0 0 0.00 8 6 4 2(gufpunqm u七 hyw; (min)圖2 m. alcaliphilum 20z胞內中間代謝物c富集的變化規律fig. 2 13c-incorporation in a time course in m. alcaliphilum 20z. m+0 represents

46、 non-labeled, m+1 representscompound with one c- label, m+2 represents compound with two c-labels, etc. f6p/g6p: fructose-6-phosphate + glucose-6-phosphate; pep: phosphoenolpyruvate; 2pg/3pg: 2-phosphoglycerate + 3-phosphoglycera.ch.1chqh cii2ociiooh* co.oxidationassimilation(kump-pathway)emp-varian

47、toj3 r3。叱-o-ohll2 ?.oh-p-o-c-c-c-ohohhofio )hi ltipon o oh ohhe6pru5pam i_ ,_j i, j.t1 mi lb oh-昨摩二。hn |(kf6pr uj j oh oh 011 66 pgohdapit孝、och.|sil3c|p5-rjvateoji廣 li!l.6 gap 6h? ch2 61、廠ii-lil liledilvarianiohon on ohokdpghoc (f p.i3c|prijvatef(niin)(eepunqe 廿二印一口m圖3丙酮酸13c示蹤分析揭示emp途徑和edd途徑的甲烷同化代謝能

48、力的差異性fig. 3 pyruvate as an indicator to distinguish between emp pathway and edd pathway. (a)overview of methane oxidation and the ribulose-monophosphate pathway(rump) for formaldehyde assimilation. (b)13c-pyruvate labelingpatterns in a time course.3討論目前對于甲烷氧化菌研究多涉及于生理、生化特征分析和重構代謝網絡，以及甲烷單加氧化酶(methane

49、 monooxygenase enzyme)催化機理與生物修復功能等的研究5。相比參與自然界碳循環的其他微生物系(如：光合作用藍細菌cyanobacterium prochlorococcus marinus 和甲烷菌methanopyrus kandleri ),甲烷氧化菌基因組研 究起步較晚而后基因組研究幾乎是空白 ,基因組和后基因組信息的缺少導致對甲烷氧化菌 代謝工程調控困難和工業化放大限制。近年來methajicpm()cabmejrhanolhfgfadh e-orni aldehydep一h.mtp-c,el 11) nalhatyoxnloacctattmeubolile cor

50、icentrationhigh圖4 emp途徑是甲烷同化代謝關鍵通路fig. 4 aschematic model depicting emp pathway is the major route for methane assimilation. the thickness of arrows indicates the level of gene expression. the color of box indicates the concentration of metabolites. ru5p: ribulose-5-phosphate; he6p: hexulose-6-phosp

51、hate; f6p: fructose-6-phosphate; g6p: glucose-6-phosphate; 6pg: 6-phosphogluconate; kdpg: 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate; gap: glyceraldehyde-3-phosphate; fbp: fructose-1,6-bisphosphate; dhap: dihydroxyacetone-phosphate; pep: phosphoenolpyruvate. gene predicted function: pmocab: particulate metha

52、ne monooxygenase; mxafi: pqq-dependent methanol dehydrogenase; fadh: 2,4-dienoyl-coa reductase; fdsacd: formate dehydrogenase; fdha : formate dehydrogenase;hps:3-hexulosephosphate synthase; hpi: phosphohexuloisomerase; pfk: fructose-2,6-biphosphatase; fba: fructose-bisphosphate aldolase; pykii: pyru

53、vate kinaseii; fdha: tungsten-containing nad-dependent formate dehydrogenase; fdsacd : formate dehydrogenase.表2 m. alcaliphilum 20z的edd和emp途徑基因表達水平比較分析table 2 gene expression profile of edd and emp pathways in m. alcaliphilum 20zgenedescriptionreactionrpkm ( x)pfppyrophosphate-fructose 6-phosphate 1

54、-phosphotransferasef6p -g6p924.00fbaafructose-bisphosphate aldolasefbp一fbp2 479.19embden-meyerhtpiatriosephosphate isomerasefbp一dhap+gap2 493.92of-parnasgapglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenasegappga2 274.64pathwaypgkphosphoglycerate kinasepga3pg488.07pgm32,3-bisphosphoglycerate-independent phosp

55、hoglycerate mutase3pg-2pg278.22enoenolase2pg-pep1 088.27entnerdoudorpgiglucose-6-phosphate isomerasef6p -g6p263.84off pathwayeda2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolasekdpgfpyr341.17edd6-phosphogluconate dehydratase6pg-kdpg225.39mary lidstrom 和 murrell colin 等課題組對 m. alcaliphilum 20z 、 m. trichos

56、porium ob3b 、 methylomicrobium buryatense strain 5g 等不同生 態環境的代表性甲烷氧化菌株進行基因組測序 注釋11,21 -22這些前期工作為基因組功能挖掘 和代謝調控機制闡明提供了重要的信息基礎。m. alcaliphilum 20z是從鹽水湖中分離純化的中 度嗜鹽和耐堿(ph7-11)的甲烷氧化菌。本研究工作整合lc-ms、rna-seq和13c同位素示蹤技 術分別從代謝物組和轉錄物組兩個層次系統研究m. alcaliphilum 20z的中心代謝網絡。甲烷被 甲烷單加氧化酶氧化生成甲醇，進而氧化成甲 醛，在3-磷酸己糖合成酶(hps)作用下，甲醛和