1、1 常規PCR實驗 PCR技術技術和和瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 1 常規PCR實驗 u掌握：掌握： 1、PCR的基本操作方法。的基本操作方法。 2、瓊脂糖凝膠電泳檢測、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的基本原理和方法。的基本原理和方法。 u理解：理解： 1、PCR儀的使用方法。儀的使用方法。 u了解：了解： 1、PCR體外擴增的原理及其引物設計原則。體外擴增的原理及其引物設計原則。 2、擴增過程中各因素對擴增結果的影響。、擴增過程中各因素對擴增結果的影響。 教學目的：教學目的： 1 常規PCR實驗 1 1、PCRPCR反應體系的建立。反應體系的建立。 2 2、瓊脂糖凝膠電泳檢測、瓊脂糖凝膠電泳檢測

2、PCRPCR產物。產物。 教學重點：教學重點： 教學難點：教學難點： 1 1、PCRPCR反應程序的設計方法。反應程序的設計方法。 1 常規PCR實驗 一、基本原理一、基本原理 聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction， PCR）：）： 體外體外DNA酶促擴增技術，能特異高效地在體外擴增酶促擴增技術，能特異高效地在體外擴增 目的目的DNA片段。片段。 PCR反應的基本步驟反應的基本步驟 變性變性 94C94C 雙鏈雙鏈DNADNA模板模板 被加熱變性成被加熱變性成 兩條單鏈兩條單鏈 退火退火 4560 C （Tm-5C） 寡聚核苷酸引物按寡聚核苷酸引物

3、按 堿基互補配對原則堿基互補配對原則 與單鏈模板與單鏈模板DNADNA特特 異結合異結合 延伸延伸 72C DNADNA聚合酶作用下，聚合酶作用下， 以引物為起始，以引物為起始， 合成與模板合成與模板DNADNA互互 補的新鏈補的新鏈 Cycle 2 5 5 5 5 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 1 5 5 Template DNA PCRPCR技術的工作原理 5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環后，模板次循環后，模板DNA的含的含 量可以擴大量可以擴大100萬倍以上。萬倍以上

4、。 1 常規PCR實驗 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶(如如Taq酶酶) dNTPs 反應緩沖液（含反應緩沖液（含Mg2+） PCR反應的基本組分反應的基本組分 1 常規PCR實驗 10PCR緩沖液（緩沖液（Mg2+ Plus） 5l dNTP混合物（混合物（2.5 mM） 4l 上游引物（上游引物（10M） 2l 下游引物（下游引物（10M） 2l DNA模板模板 4l Taq DNA聚合酶（聚合酶（2.5 U/l） 1l 去離子水去離子水 32l 實驗步驟一：實驗步驟一：PCRPCR反應體系的建立（重點）反應體系的建立（重點） 50 l 2 3 4 5 6

5、 7 1 加樣順序加樣順序 25cycles25cycles 實驗步驟二：實驗步驟二： 1 常規PCR實驗 PCR程序設計的主要因素程序設計的主要因素 循環溫度和時間循環溫度和時間 Tm的概念：的概念： 在雙鏈在雙鏈DNA解鏈過程中，紫外吸光度的變化解鏈過程中，紫外吸光度的變化 A260達到最大變化值的一般時所對應的溫度。達到最大變化值的一般時所對應的溫度。 Tm計算方法計算方法 堿基數小于堿基數小于20： Tm=4(GC%)+2(AT%) 堿基數大于堿基數大于20： Tm=81.5+0.41(GC%) (675/引物長度引物長度) 1 常規PCR實驗 主要實驗儀器主要實驗儀器 PCR儀儀 1

6、 常規PCR實驗 主要實驗儀器 PCR儀儀 1 常規PCR實驗 實驗步驟三：結果檢測實驗步驟三：結果檢測 瓊脂糖電泳檢測瓊脂糖電泳檢測PCRPCR產物產物 1. 1. 試劑：試劑： 5050TAETAE電泳緩沖液：電泳緩沖液：Tris 242 gTris 242 g，乙酸，乙酸57.1 ml57.1 ml， 0.5 0.5 mol/L EDTAmol/L EDTA（pH 8.0pH 8.0）100 ml100 ml，定容至，定容至1 L1 L，高壓滅菌后，高壓滅菌后 備用。備用。 1 1TAETAE電泳緩沖液：電泳緩沖液：20 ml 5020 ml 50TAETAE電泳緩沖液加入雙蒸水，電泳緩

7、沖液加入雙蒸水， 定容至定容至1 L1 L。 2. 12. 1瓊脂糖凝膠的配制：瓊脂糖凝膠的配制： 100 ml TAE100 ml TAE電泳緩沖液中加入電泳緩沖液中加入1 g1 g瓊脂糖，搖勻后放入微波瓊脂糖，搖勻后放入微波 爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至 5656左右時，加入微量（左右時，加入微量（3.5 L）的）的EBEB（溴化乙錠溴化乙錠），混，混 勻后倒入槽中，冷卻后待用。勻后倒入槽中，冷卻后待用。 1 常規PCR實驗 不同類型瓊脂糖分離不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍片段大小的范圍 瓊脂糖/標準高強度低熔點

8、0.3 0.5700bp25kb 0.8500bp15kb 800bp10kb 800bp10kb 1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb 1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb 1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb 1 常規PCR實驗 3. 3. 上樣上樣 反應結束后取反應結束后取5L5L反應產物，加入反應產物，加入1L1L上樣緩沖上樣緩沖 液（液（6 6loading bufferloading buffer），用），用1%1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 檢測。檢測。 指示劑：溴酚藍指示劑：溴酚藍 MarkerMarker：DL2000D

9、L2000。 注意：注意： 加樣孔位于負極，加樣孔位于負極，DNADNA由負極向正極泳動由負極向正極泳動 4060 1 常規PCR實驗 4. 4. 電泳電泳 電泳電泳100 V100 V，10 min10 min左右左右。 5. 5. 觀察觀察 凝膠成像系統或紫外燈下觀察結果凝膠成像系統或紫外燈下觀察結果 （手套拿取凝膠）（手套拿取凝膠） 1 常規PCR實驗 三、注意事項三、注意事項 1 1、注意移液槍的正確使用方法。、注意移液槍的正確使用方法。 2 2、按順序逐一加入、按順序逐一加入PCRPCR反應體系各組分，切勿遺漏。反應體系各組分，切勿遺漏。 3 3、取用各組分時，應避免污染和貼槍頭壁損

10、失。、取用各組分時，應避免污染和貼槍頭壁損失。 4 4、按操作步驟正確設置使用、按操作步驟正確設置使用PCRPCR儀。儀。 5 5、帶手套操作實驗。、帶手套操作實驗。 1 常規PCR實驗 四、影響四、影響PCR反應的因素反應的因素 1 1、模板、模板 任何任何來源的來源的各種構型的含量極低的各種構型的含量極低的DNA樣品都樣品都 可作可作PCR的模板。的模板。 輕微的污染輕微的污染都會影響都會影響PCR的最終結果。的最終結果。 2 2、脫氧核苷三磷酸（、脫氧核苷三磷酸（dNTPsdNTPs） 4 4種種dNTPdNTP在反應中濃度應相等，過高會抑制在反應中濃度應相等，過高會抑制TaqTaq 酶

11、活性，增加錯配的幾率。酶活性，增加錯配的幾率。 1 常規PCR實驗 3 3、引物、引物( (引物的好壞是整個引物的好壞是整個PCRPCR反應的關鍵反應的關鍵) ) 引物濃度一般為引物濃度一般為0.10.10.5mmol/L0.5mmol/L，濃度太高，會增加非特，濃度太高，會增加非特 異性擴增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴增異性擴增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴增效率效率 和產率。和產率。 * *引物設計的原則引物設計的原則 長度長度1515 30bp30bp GCGC含量含量4545 55%55% 兩條引物退火溫度一致或接近，兩條引物退火溫度一致或接近，TmTm差值小于差值小于55

12、無連續核苷酸無連續核苷酸 引物內部及引物間無互補，以免形成發夾結構和引物引物內部及引物間無互補，以免形成發夾結構和引物 二聚體二聚體 1 常規PCR實驗 特異性的引物：特異性的產物特異性的引物：特異性的產物 1 常規PCR實驗 4 4、MgMg2+ 2+濃度 濃度 MgMg2+ 2+是 是DNADNA聚合酶發揮聚合酶發揮 作用的必須成分；作用的必須成分； 最適濃度一般為最適濃度一般為0.5-0.5- 2.5mmol/L,2.5mmol/L,濃度過低濃度過低 則無法啟動反應，過則無法啟動反應，過 高則影響產物特異性。高則影響產物特異性。 1 常規PCR實驗 5 5、Taq DNATaq DNA聚

13、合酶聚合酶 具有具有5 533DNADNA聚合活性外，還具有聚合活性外，還具有 5 533DNADNA外切活性。因此，在某些時候可選外切活性。因此，在某些時候可選 擇具有校讀活性的聚合酶例如擇具有校讀活性的聚合酶例如PfuPfu； 可以根據需要選擇擴增長片段的可以根據需要選擇擴增長片段的TaqTaq酶，高速擴酶，高速擴 增的增的TaqTaq酶等酶等 反應終濃度以反應終濃度以2 22.5 U/1002.5 U/100l l為最佳為最佳 問題問題1 1：無擴增產物：無擴增產物 現象：正對照有條帶，而樣品則無現象：正對照有條帶，而樣品則無 M樣品樣品A 樣品樣品B 正對照正對照 純度：含有抑制物純度

14、：含有抑制物 濃度：含量低濃度：含量低 質量：全長質量：全長 結構：二級結構結構：二級結構 原原 因因 對對 策策 純化模板或者使用優質純化模板或者使用優質 試劑盒提取模板試劑盒提取模板DNADNA 加大模板的用量加大模板的用量 用好的反轉錄酶用好的反轉錄酶 用溫度高的反轉錄酶用溫度高的反轉錄酶 (1)(1)無擴增產物之無擴增產物之模板原因模板原因 引物錯誤引物錯誤 引物設計不好引物設計不好 引物降解引物降解 引物合成、純化不好引物合成、純化不好 原原 因因 對對 策策 合成前檢查合成前檢查 評價、重新設計引物評價、重新設計引物 換一管新引物換一管新引物 免費重新合成免費重新合成 (2)無擴增

15、產物之引物原因 退火溫度退火溫度 延伸時間延伸時間 循環次數循環次數 原原 因因 對對 策策 遞度遞度PCRPCR 聚合酶的延伸速度聚合酶的延伸速度 適當增加循環數適當增加循環數 (3)(3)無擴增產物之無擴增產物之PCRPCR條件原因條件原因 現象：現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶 問題問題2 2：非特異性擴增：非特異性擴增 M 1 2 引物特異性差引物特異性差 模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高 酶量過多酶量過多 MgMg2+ 2+濃度偏高 濃度偏高 退火溫度偏低退火溫度偏低 循環次數過多循環次數過多 原原 因因 對對 策策 重新設計引物或者使用巢重新設計引物或者使用巢 式式PCRPCR 適當降低模板或引物濃度適當降低模板或引物濃度 適當減少酶量適當減少酶量 降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度 適當提高退火溫度或使用適當提高退火溫度或使用 二階段溫度法二階段溫度法 減少循環次數減少循環次數 非特異性擴增非特異性擴增 靶序列或擴增產靶