1、獸用疫苗生產與質量控制 主要內容 1.獸用生物制品簡介 2.疫苗的定義和分類 3.疫苗生產工藝簡介 4.疫苗生產質量控制 5.疫苗研究發展趨勢 一、獸用生物制品簡介 獸用生物制品概念 獸用生物制品分類 1、獸用生物制品概念 概念：系用天然或人工改造的微生物、寄生蟲、 生物毒素或生物組織及代謝產物等為材料，采 用生物學、分子生物學或生物化學等相應技術 制成的一類生物活性制品，用于預防、治療和 診斷畜禽等動物疾病 獸用生物制品學科：是一門涉及多種學科領域 的應用科學（微生物學、免疫學、生物化學、 實驗動物學、細胞學、分子生物學、制冷學、 生物工程學、管理學等） 2、獸用生物制品分類 按生物制品性質

2、分類 疫苗（vaccine）：接種動物后能產生自動免 疫和預防疾病的一類生物制劑稱為疫苗。 類毒素（toxoid）：又稱脫毒毒素，是指細菌 生長繁殖過程中產生的外毒素，經化學藥品 （如甲醛）處理后成為無毒性但保留免疫原性 的生物制劑，接種動物后也能產生自動免疫， 產生抗毒素血清。 診斷制品（diagnostic preparation）：利用 微生物、寄生蟲及其代謝產物，或動物血清、 組織等，根據免疫學和分子生物學原理制備， 用于疫病診斷、免疫監測和病原鑒定的一類生 物制劑。 抗病血清（antiserun）：或高免血清，為含 有高效價特異性抗體的血清，能用于治療或緊 急預防相應病原體所致的疾病

3、。 微生態制劑（probiotics）：又稱活菌制劑， 是用非病原微生物如乳酸桿菌、雙歧桿菌等活 菌制劑，口服治療畜禽腸道正常菌群失調引起 的下痢。 副免疫制品（paraimmunity preparation）： 這類物質能通過刺激機體，提高特異性和非特 異性免疫，從而使動物機體對其他抗原物質的 特異性免疫力更強更持久，如脂多糖、多糖、 緩釋微球、細胞因子，免疫刺激復合物等。 普通制品：指用一般方法制備的、未經濃縮和 純化處理，或僅按毒（效）價標準稀釋的制品。 如現有國內的大部分傳統疫苗均為普通制品。 精制生物制品：將普通制品（原制品）經濃縮 和純化處理，去除無效成分，毒（效）價高于 普通制

4、品效力更好，如精制破傷風毒素和精制 結核菌素等。 液狀制品：濕性制品。一些滅活疫苗如兔病毒性出血 癥滅活疫苗 ，診斷制品如血清、抗原等為液狀制品。 多數既不耐高溫和陽光，又不宜低溫凍結和反復凍融， 否則其效價會受到影響，只能在低溫冷暗處保存，保 存時間較短。 干燥制品：液狀制品加入適當穩定劑或凍干保護劑經 冷凍真空干燥處理，將96%以上水分除去后剩留疏松海 綿狀的物質，為干燥制品，生物制品經干燥后能較長 時間保護活性和抗原效價。 佐劑制品：為了增強疫苗制劑誘導動物機體的免疫應 答反應，提高免疫效果，在疫苗制備的過程中加入適 量的佐劑，如氫氧化鋁膠、油佐劑等，這類制品稱為 佐劑制品。 二、疫苗的

5、定義和分類 疫苗定義 疫苗分類 1、疫苗定義 由特定細菌、病毒、立克次體、衣原體等微生 物及寄生蟲制成的，接種動物后能產生自動免 疫和預防疾病的一類生物制劑均稱為疫苗，制 劑的主要成分為微生物或寄生蟲。 2、分類 按微生物分類 細菌類疫苗 病毒類疫苗 寄生蟲類疫苗 按疫苗抗原的性質和制備工藝分類 活疫苗（live vaccine） p弱毒活疫苗 p基因缺失疫苗 p基因工程活載體疫苗 p病毒抗體復合疫苗：特異性高免血清與適當比 例的相應病毒組成，其特點是可以延緩病毒釋 放，提高疫苗的安全性和免疫效果。 活疫苗特點 p可在體內繁殖 p系統免疫反應和局部免疫反應 p免疫力持久，產量高，成本低 p有毒

6、力增強和反祖危險 p抗原干擾現象 p保存條件苛刻 死疫苗（killed vaccine） p滅活疫苗：由完整的病毒或細菌經滅活劑滅活 后制成，即要使病原體充分死亡，喪失感染性 或毒性，又要保留其免疫原性。 p亞單位疫苗：是指將病原體經物理或化學方法 處理，除去無效物質，提取其有效抗原部分制 備的一類疫苗，經提取、純化，通過化學合成， 制成不同的亞單位疫苗。 p基因工程重組亞單位疫苗：利用DNA重組技術， 將編碼病原微生物保護性的基因 導入原核或 真核細胞，使其在受體細胞中高效表達，分泌 保護性抗原肽鏈，提取肽鏈加入佐劑制成。該 類疫苗安全性好，副反應小（有害的反應原 少），穩定性好，便于保存和

7、運輸，但研發、 生產成本高，免疫原性較差，需多次免疫才能 得到有效保護。 死疫苗特點 p不能在體內繁殖 p有利于制備多價或多聯疫苗 p比較安全，不發生全身性副反應，無毒力反祖 現象 p受外界影響小，有利于保存運輸 p免疫劑量大，需多次免疫，成本高 p只能誘導機體產生體液免疫 p通常需要用佐劑或攜帶系統來增強其免疫效果 基因疫苗（genetic vaccine）： 包括DNA疫 苗和RNA疫苗，是將編碼某種抗原蛋白的基因 置于真核表達元件的控制下，構成重組表達質 粒DNA或RNA，將其直接注入動物體內，通過宿 主細胞的轉錄翻譯系統合成抗原蛋白，從而誘 導宿主產生抗原蛋白的免疫應答。 單價疫苗（u

8、nivalent vaccine）：利用同一種微 生物（菌）毒株或同一種微生物中的單個血清型 （菌）毒株的增殖培養物制備的疫苗。 多價疫苗（polyvalent vaccine）：利用同一種 微生物（菌）毒株或同一種微生物中的多個血清 型（菌）毒株的增殖培養物制備的疫苗 多聯疫苗（mixed vaccine）：利用不同的微生 物增殖培養物，按免疫學原理和方法組合而成的 疫苗。接種動物后能獲得相應疾病的免疫保護， 一針多防，可減少勞動力和動物應激。 按疫苗病原菌（毒）株來源分類 同源疫苗：采用同種、同型或同源微生物制備， 應用于同類動物免疫接種的疫苗。 異源疫苗：采用不同種微生物的（菌）毒株制

9、備的疫苗，接種動物后能使其獲得對疫苗中未 含有的病原體產生抵抗力，如犬在接種麻疹疫 苗后，能產生對犬瘟熱的抵抗力。或采用同一 種中一種型微生物的（菌）毒株制備的疫苗， 接種動物后能使其獲得對異型病原體的抵抗力。 三、疫苗生產工藝介紹 疫苗生產基本條件 疫苗生產工藝流程 生產中影響疫苗質量的關鍵環節 疫苗抗原制造技術介紹 疫苗檢驗 疫苗保存 1、疫苗生產基本條件 產品批準文號 菌（毒）種 疫苗制造及檢驗規程 GMP廠房、設施和儀器設備 產品批準文號 農業部頒發批準文號 GMP證書(具備該疫苗生產線) 產品復核檢驗(具備生產該疫苗的能力) 標簽、說明書樣稿審查(符合規程規定) 省級文號？ 菌 （毒

10、）種 菌（毒）種是疫苗生產必備的原材料，國家對 菌（毒）的保管和使用有嚴格的規定和限制 （生物安全問題）。 生產疫苗的菌（毒）種來源：中國獸醫藥品監 察所或新獸藥轉讓單位。 菌（毒）種保管和使用：基礎種毒由中國獸醫 藥品監察所或其委托的保管單位進行生產、鑒 定和保管，生產用種子批由企業生產、鑒定和 保管。 菌 （毒）種分類 菌（毒）種分強毒和弱毒 強毒：通常指從得病動物體內分離到的致病毒 株，只能用于制造滅活疫苗和檢驗用 弱毒：通常是采用人工的方法用強毒致弱而成， 一般于制造活疫苗 菌 （毒）種質量標準 生物學特性明顯、歷史清楚：形態、培養特性、 生化特性及血清免疫學特性等明顯，易于鑒別； 人

11、工感染動物引起穩定一致的臨床癥狀和病理 變化特征；原始細菌或病毒株的來源地區、動 物品種流行資料清楚；分離鑒定資料完整；傳 代、保藏和生物學特性檢查方法明確。 遺傳學上相對純一與穩定：菌毒種在傳代增殖 過程中某些遺傳形狀會發生改變和分離，如形 態特征、毒力、反應原性、免疫原性等方面， 因此要求制造生物制品的菌（毒）種的這種改 變和分離越小越好，應經常進行挑選，純化和 克隆。 反應原性和免疫原性優良：反應原性高，即使 微量量的抗原物質進入機體內既能產生強烈的 免疫反應，血清學上會出現很高的特意性；優 良的免疫原性物質能使免疫動物產生完善的免 疫應答，從而獲得堅強的免疫力 毒力應在規定的范圍以內：

12、用于制造弱毒疫苗 的菌毒種，毒力應盡量弱一些；用于制造抗血 清、滅活疫苗和疫苗效力檢測的菌（毒）種毒 力應強，且抗原性要盡量高 菌（毒）種的篩選程序和內容 細胞 EID50ELD50TCID50 穩定性實驗 凍干、冷凍或冷藏保存 反應原性免疫原性 血清學實驗攻毒保護實驗 病毒分離 純粹性試驗 致病性試驗抗原性試驗 原動物 LD50 篩選出毒力強、抗原性好、生長穩定、純凈的毒株，用于制備疫苗、診斷液和治療 用抗體或疫苗效力檢驗用 實驗動物雞胚細胞反應原性 純粹性試驗 抗原性試驗 原動物 致病性試驗 病毒分離 弱毒菌（毒）種的選育 弱毒菌（毒）種的選育 自然弱毒株的分離人工誘變致弱 同源動物 （如

13、NDV LaSota株） 異源動物 （HVT FC126株） 化學途徑物理途徑生物途徑 亞硝基胍 醋酸坨 洗衣粉 高溫 紫外線 適應非易感動物 或細胞 雜交減毒 疫苗制造及檢驗規程 任何一種疫苗都有其制造及檢驗規程，它 是國家法定標準。 疫苗的生產必須嚴格按規程規定的方法進 行生產和檢驗，若要改變方法，則要提供研究 材料證明是可行的，并報農業部評審批準，形 成新規程才能進行生產。 規程來源 p中華人民共和國獸用生物制品規程（常規疫苗） p轉讓單位（新獸藥） 廠房、設施和儀器設備 GMP證書是疫苗生產的準入證， 疫苗生產 必需擁有與生產工藝相符合的生產線 GMP 生產車間設計要求 p功能區：抗原

14、制備區、成品生產區、洗滌區、辦公 區。各區域和功能間以潔凈走廊相連，嚴格按人流 物流分開原則進行設計。 p潔凈度：按各功能間潔凈度、壓力、壓差要求設計 施工。有10萬級區、萬級區和局部百級區。 p六大系統：供電、供水、供汽、污水處理、凈化、 監控。 廠房、設施和儀器設備 檢驗設施 p質檢室 p檢驗動物舍（應配備有符合各類實驗動物級別 飼養設施） 倉儲設施 p原輔材料庫 p半成品庫 p成品庫 廠房、設施和儀器設備 滅菌設備：高壓蒸氣滅菌柜、干熱箱、鍋爐等； 凈化設備：凈化機組、無菌室、超凈工作臺等； 微生物培養設施設備：溫室、孵化器、細胞培養轉瓶 機、各種罐體、生化培養箱等； 乳化設備：各種罐體

15、、膠體摸、高壓勻漿機等； 凍干設備：凍干機； 灌裝設備：洗烘連動線、自動灌裝加塞聯動機； 包裝設備：扎蓋機、帖標機； 冷藏冷凍設施設備：冷庫、冷柜、液氮罐等； 污水廢棄物處理設施設備：滅菌柜、消毒罐、污水處 理站； 檢驗儀器設施設備：各種顯微鏡、水分測定儀、二氧 化碳培養箱、生物安全柜、動物房等。 福州大北農公司總體布局圖 主主 廠房廠房 大動物房大動物房 小動物房小動物房 質檢樓質檢樓 鍋爐房鍋爐房 污水污水 處理站處理站 脾林苗脾林苗 倉儲倉儲 辦公區辦公區 大門大門 生活區生活區 疫苗生產工藝流程 菌（毒）種 培養物（培養基、動 物、禽胚或細胞等） 收獲抗原（培養 液、含毒組織、胚液或細

16、胞液等） 配苗 分裝 凍干成活疫苗或滅活后制成滅 活疫苗。 細菌疫苗的制造流程 蛋白胨、肉浸液等原料 培養基培養基 配制、滅菌 菌種生產用種子生產用種子 培養 菌液菌液 菌苗原液 配苗 分裝凍干凍干、扎蓋帖簽 活疫苗 原料 佐劑佐劑 滅活菌液 配苗乳化乳化 分裝、扎蓋、帖簽 滅活疫苗 滅活滅活 檢驗 配制、滅菌 保護劑保護劑 原料 配制、滅菌 病毒性細胞疫苗的制造工藝流程 健康動物（或胚胎） 組織 原料 細胞懸液細胞懸液 生長細胞 病毒液病毒液 配苗 分裝凍干凍干、扎蓋帖簽 活疫苗 基礎種毒 生產用種毒生產用種毒 原料 保護劑保護劑 配制 滅菌 細胞培養液 傳代細胞傳代細胞 滅活病毒液 配苗（

17、混勻、乳化乳化） 分扎蓋帖簽裝 滅活疫苗 檢驗 原料 佐劑佐劑 配制 滅菌 滅活滅活 檢驗 配制 培養收獲 病毒性組織疫苗的制造工藝流程 感染動物或胚胎 分裝、扎蓋、貼簽 健康動物或SPF雞胚等 健康動物或健康動物或SPFSPF雞胚等雞胚等 動物或SPF雞胚等 基礎種毒 生產用種毒生產用種毒 收獲感染組織或胚液收獲感染組織或胚液 純化配制成含毒懸液 配苗 分裝凍干凍干 活疫苗 保護劑保護劑 原料 配制 檢驗 滅活病毒液 配苗、乳化乳化 滅活疫苗 原料 佐劑 配制 滅活滅活 檢驗 影響疫苗質量的關鍵環節 活疫苗 生產用菌（毒）種的制備是否優良 制苗用抗原制備（微生物增殖）是否高效 凍干保護劑的選

18、擇和凍干曲線的制定是否合理 滅活疫苗 生產用菌（毒）種的制備是否優良 制苗用抗原制備（微生物增殖）是否高效 抗原滅活是否徹底 乳化工藝是否先進 疫苗抗原制造技術介紹 細菌類疫苗抗原增殖技術（培養基增殖） 細菌培養是指細菌在動物體外的人工培養基上 以及人工控制的環境中（通常用培養罐進行培 養）生長繁殖的過程。細菌性疫苗都是利用培 養基制造的，首先通過分離培養，獲得單個菌 落，制備細菌種子，然后逐級培養進行規模化 生產。 細菌類疫苗抗原增殖技術（關鍵控制點） 培養基質量：培養細菌類疫苗抗原的培養基一 般是人工制備的一種液體培養基，它含有培養 相應細菌所需營養成分，包括水、氮源、碳源、 無機源和生長

19、因子等它的好壞直接影響到產菌 量和檢驗結果。 生產用菌種 菌落挑選符合細菌培養特性 活菌含量符合要求 純凈無污染 代次按規定控制 工藝的穩定性 培養條件 工藝技術（各種參數如種子接種量、培養時間、收 獲時間等） 傳統病毒類疫苗抗原增殖技術 動物增殖 禽胚增殖 細胞增殖 5、疫苗檢驗 活疫苗 物理性狀（凍干苗） 無菌檢驗（純粹檢驗） 鑒別檢驗：特異性血清中和檢驗。 外源病毒檢驗（病毒類疫苗）：中和法檢驗。 活菌計數（細菌類疫苗）：平板計數。 病毒含量測定（病毒類疫苗） ：EID50、ELD50 或TCID50。 安全檢驗：動物或雞胚（劑量幾倍至幾十倍） 效力檢驗：攻毒保護或微生物含量測定。 水份

20、測定（凍干苗）：4%以內。 真空度測定（凍干苗）：白色、粉色或紫色輝 光。 滅活疫苗 滅活檢驗：半成品檢測：EID50、ELD50或 TCID50 。 物理性狀：外觀、劑型、穩定性、粘度檢驗。 無菌檢驗：培養基檢測 安全檢驗：動物檢驗 效力檢驗：攻毒保護或測抗體。 滅活劑含量測定：化學分析 6、疫苗保存 疫苗對溫度極為敏感，保存不當會使效價嚴重 受損（尤其是活疫苗）或劑型破壞，并導致疫 苗失效，因此應嚴格在規定的條件下保存。 7、豬瘟活疫苗產品介紹 種類：豬瘟活疫苗根據抗原制備途徑不同又分 為： 豬瘟活疫苗（成兔脾淋源） 豬瘟活疫苗（乳兔源） 豬瘟活疫苗（細胞源） 豬瘟活疫苗（牛體源） 疫苗研

21、究和發展歷史背景 3.6豬瘟活疫苗產品介紹 生產和使用對比 疫苗類型使用種毒抗原制備方法質量標準生產成本臨床使用 豬瘟活疫 苗（成兔 脾淋源） 豬瘟兔化弱 毒 接種成兔，采 集兔體脾淋組 織 150個RID高非特異免疫強 抗原含量高 過敏率低 豬瘟活疫 苗（乳兔 源） 豬瘟兔化弱 毒 接種乳兔，采 集乳兔肌肉組 織 150個RID較高無非特異免疫 抗原含量較低 過敏率高 豬瘟活疫 苗（細胞 源） 豬瘟兔化弱 毒 接種牛睪丸細 胞，收貨細胞 培養液 750個RID （新標準 7500 RID） 低無非特異免疫， 抗原含量高， 過敏率較高 豬瘟活疫 苗（牛體 源） 豬瘟兔化弱 毒 接種犢牛，采 集

22、犢牛脾淋組 織 150個RID較底非特異免疫強 抗原含量高 過敏率低 豬瘟活疫苗質量控制要素 菌毒種 純凈（細菌和外源性病毒污染） 含毒量高于國家標準 代次控制在5代以內 原材料的選擇 組織苗 p家兔的選擇（兔種、年齡、體重、健康狀況等） p乳兔的選擇（日齡、體重、健康狀況等） 細胞苗 p細胞的選擇（無污染外原病毒等） 豬瘟活疫苗質量控制要素 生產環境控制 組織苗 p動物飼養條件控制 p接毒后動物反應觀察與判斷 p生產線功能間潔凈級別要求 細胞苗 p細胞檢測（BVDV等） p健康細胞和接毒后細胞的觀察與判斷 p生產線功能間潔凈級別要求 半成品檢測 成品檢測 四、疫苗生產質量控制 質量控制意義

23、質量控制要求 質量控制保證措施（獸藥GMP管理） 疫苗質量評價 1、質量控制意義 國家強制要求 禽流感事件，人血白蛋白事件 企業自身要求 品牌、效益、責任 生物制品特殊性表現在 在生產和使用過程中人和動物的安全性 （污染、混毒、人畜共患） 對環境的安全性 群體性危害 2、質量控制要求 安全性：毒副作用、殘留、環境、人類 有效性：有效成分達到要求，療效確切 均一性：批間、最小單元間、貯存運輸后等 穩定性：貯存期穩定，有較長的有效期 方便性：給藥的方式、途徑 經濟性：在保證質量的前提下，改進生產工藝，提 高效力，降低成本 3、保證措施獸藥GMP管理 GMP是英文Good Manufacturing

24、 Practice for Drugs的縮寫，直譯為“優良產品的生產 實踐”。我國的獸藥GMP是藥品生產質 量管理規范的簡稱。 獸藥GMP是在獸藥生產過程中，用科學、 規范化的條件和方法來保證生產優良獸藥的整 套科學體系。它實施的目標就是對獸藥生產的 全過程進行質量控制，以保證生產的獸藥質量 是合格優良的。 3、保證措施獸藥GMP背景 GMP是從藥品生產實踐中取得經驗教訓的總結。 人類社會經歷了12次藥物災難，特別是20世紀出現的 藥物災難“反應停”事件后，公眾要求制定嚴格監督 法律； 最早的GMP是由美國坦普爾大學6名教授編寫制定； 1963年美國頒布第一部GMP，美國FDA經過實施； 19

25、75年WHO正式公布GMP，開始向成員國推薦，并確定 為WHO的法規之一，迄今為止有100多個國家實施了GMP； 我國醫用藥品從1982年開始頒布GMP，農業部于己于 1989年頒布并決定實施GMP，規定至2005年12月31日未 取得GMP合格證的企業，不得進行藥品生產。 3、保證措施控制要求 生產、管理人員生產、管理人員 廠房、設施、設備廠房、設施、設備 原料、包裝材料原料、包裝材料 生產方法生產方法 檢驗、監控檢驗、監控 售后服務售后服務 經檢驗合格的經檢驗合格的 經過驗證的經過驗證的 可靠的可靠的 完善的完善的 經驗證合適的經驗證合適的 訓練有素的訓練有素的 GMPGMP 基本控制要求基本控制要求 影響質量的因素影響質量的因素 完善的完善的管理文件管理文件 3、保證措施控制要求 在GMP管理要求中，3條主線貫穿全過程 生產處處防污染：原材料或產品被微生物或外來物 攙雜、玷污、混雜、失真、遺漏、任意等造成產品 的質量問題，生產過程對環境和人員的安全性： 事物件件有驗證：能證明任何程序、