1、設(shè)計實驗報告,1103018 宋 躍 1103019 胡嘉健 1103020 劉炫邑 1103021 石雨晴,Experimental design report,一，如何正確設(shè)計從生物樣品中分離純化生物大分子的路線和正確的設(shè)計方案？ 二，案例實驗：從動物肝組織樣品中分離提取純化鑒定一種酶,如何正確設(shè)計從生物樣品中分離純化生物大分子的路線和正確的設(shè)計方案,1，確定生物大分子的種類 2，查閱文獻(xiàn)資料確定生物大分子的性質(zhì)例如，分子量，等電點，沉降細(xì)數(shù)溶解度，耐熱性等 3，查閱分離純化鑒定的方法以及其各有何特點和適用范圍 4，根據(jù)所測生物大分子的已知條件和實際情況選擇合適的分離純化方法 5，根據(jù)選取

2、的方法設(shè)計實驗具體步驟,1，正確選材 總的來說，材料選擇應(yīng)遵循的原則是：有效成分含量多，穩(wěn)定性好；來源豐富、保持新鮮；提取容易、工藝簡單；雜質(zhì)有綜合利用價值。 2，材料預(yù)處理 及時使用避免有效成分喪失，否則應(yīng)及時冰凍或干燥儲存，同時把易于除去的非需要物質(zhì)（如脂質(zhì)）除去。 3，初分 根據(jù)目標(biāo)大分子的性質(zhì)確定初分方法，保證回收率高,4，純化 按照先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法，后選擇精確、費時和需樣品量少的方法的原則確定分離方法的排布順序。 5，鑒定 用于鑒定性質(zhì)和含量的方法有：光譜法、氣象層析法和生物芯片法等。用于鑒定生物樣品純度的方法有：電泳法、免疫分析。 根據(jù)實驗?zāi)康?/p>

3、確定鑒定方法，操作務(wù)必準(zhǔn)確，盡量避免目標(biāo)物質(zhì)的流失,案例實驗： 從動物肝組織樣品中分離提取純化鑒定一種酶,實驗?zāi)康模?1，掌握從肝細(xì)胞中分離提取純化鑒定某種酶的實驗方法 2，培養(yǎng)靈活選擇并綜合使用各種生物實驗方法的能力 3， 培養(yǎng)探索精神及團(tuán)隊合作意識,一，材料預(yù)處理 1，因動物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗材料。 2，由于細(xì)胞膜的半透膜性質(zhì)，將細(xì)胞置于低滲溶液中，細(xì)胞易脹破，通過攪碎研磨可以得到細(xì)胞質(zhì)中的胞液以及細(xì)胞核等各種細(xì)胞器和少量的細(xì)胞器碎片。 3，由于目前未知該酶的具體位置，因此對胞液，細(xì)胞核和線粒體應(yīng)該分開研究，使得提取物中雜質(zhì)盡量減少

4、,實驗原理,二，鹽溶液提取法(Salt solution extraction method ) （將線粒體和細(xì)胞核中的酶分別用鹽溶液提取） 根據(jù)蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)及溶解性質(zhì)的不同選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行提取。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)的溶解度大，穩(wěn)定性好，在蛋白質(zhì)和酶的提取過程中經(jīng)常采用。故本實驗采用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液,實驗原理,三， 鹽析原理(Salting out ) 蛋白質(zhì)在水中以膠體形式存在是由于表面附有水化膜和表面電荷，在鹽析過程中，鹽溶液中的離子破壞了這兩個因素使得蛋白質(zhì)能夠凝聚在一起沉淀下來達(dá)到分離的目的。利用離心的方法將沉淀和上清液分離,實驗原理,四，等電點沉淀(Isoe

5、lectric point precipitation ) 利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，及不同兩性電解質(zhì)的等電點不同這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值或鹽濃度，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法,實驗原理,五，離子交換柱層析(Ion exchange column chromatography )， 按照可交換離子的類型分為陽離子交換柱色譜法和陰離子交換柱色譜法。根據(jù)物質(zhì)酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和解吸而將電解質(zhì)各組分分開。 在離子交換過程中，可以將雜蛋白選擇性地結(jié)合到離子交換劑上，其余蛋白存在于過柱液中;或?qū)⒂蛛x蛋白選擇性地結(jié)合到離子交換劑上，雜蛋白存在于過柱液中;

6、或幾種帶同性電荷的蛋白均結(jié)合到交換劑上，利用其結(jié)合的牢固程度不同(即帶電荷的數(shù)目不同)，靜電引力不同，分步洗脫下來，達(dá)到分離的目的,實驗原理,六，脫鹽 經(jīng)過各種純化手段提取的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)常含有較高的鹽離子濃度，需要將多余的鹽離子去除，稱為蛋白質(zhì)的脫鹽，脫鹽的主要方法有透析法，超濾法，凝膠過濾法等,實驗原理,七，SDS電泳(SDS electrophoresis ) 該方法中，由于該蛋白質(zhì)有三個大小不同的亞基，所以將會形成三條不同的區(qū)帶。達(dá)到了實驗鑒定的目的,SDS-PAGE：使用陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉，先將蛋白質(zhì)大分子變性，并與其蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體沿著以聚丙烯酰

7、胺凝膠形成的分子篩向電場的正極方向移動，從而將蛋白質(zhì)根據(jù)它們分子量的大小而分開。由于小分子量的蛋白質(zhì)移動速度大于分子量較大的，所以在垂直凝膠中其蛋白質(zhì)分子量由上至下遞減,實驗原理,實驗步驟,實驗取材 因動物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗材料,細(xì)胞破碎 加入蛋白質(zhì)抑制劑，防止蛋白酶水解作用（常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） ） 除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需要大量的試驗來選定，已知的有1%2%的鏈霉素

8、硫酸鹽、溶菌酶等,破碎方法：機械研磨 將剪碎的兔肝置于研缽中用研磨棒研碎，（加入一定的石英可提高研磨效果）也可用勻漿器進(jìn)行勻漿，加入低滲溶液。運用差速離心法在1600r/min 離心機中離心得到上清一和沉淀一。將沉淀加入一定濃度蔗糖溶液后在3500r/min離心機離心得到上清二和沉淀二（細(xì)胞核）。將上清一二混合，取少量上清液在6600r/min離心機中離心得到沉淀三是線粒體，棄去上清液（微粒體與溶酶體） 最后得到上清液為胞液，沉淀二為細(xì)胞核，沉淀三為線粒體 以下步驟分別對三部分進(jìn)行操作,酶的分離提取 鹽溶液提取（適用于大多數(shù)酶。 ） 用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液提取線粒體和細(xì)胞核中的酶,一

9、，初分，鹽析 使用飽和硫酸銨以一定的恰當(dāng)比例，使蛋白質(zhì)析出，視具體情況通過過濾和離心的方法沉淀分離出來，得到的沉淀即為蛋白質(zhì) 等電點沉淀法 將上一步得到的沉淀溶解在ph為6.2的緩沖液中，離心后得到上清液和沉淀， 棄去上清，沉淀即為所有pI為6.2的蛋白質(zhì) 二，精分，離子交換柱層析法 利用DEAE纖維素（為）作為陰離子交換劑，帶有正電荷可以吸附帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì) DEAE預(yù)處理，裝柱，平衡樣品上樣與洗脫收集得到相對純凈的蛋白質(zhì) 利用CM-纖維素（ph為5.0）作為陽離子交換劑，吸附帶正電荷的酶 DEAE的再生與保存,實驗步驟,如何使線粒體和細(xì)胞核破碎,脫鹽，使用透析袋脫鹽 SDS電泳，1，制備待測蛋白質(zhì)樣品：2，垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠的灌制：3，加樣：4，電泳：5，剝膠：6，染色和褪色,實驗步驟,實驗結(jié)果： 觀察脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)區(qū)帶，若被測蛋白質(zhì)樣品分離純化的好，純度高，應(yīng)出現(xiàn)三條區(qū)帶，若在同一凝膠板不同泳道上加一個