通往精準醫學之路國際著名的生物物理學家、哈佛大學化學與化學生物學系講席教授、美國科學院院士、北京大學生物動態光學成像中心（BIOPIC）主任謝曉亮日前獲得美國生物醫學大獎阿爾伯尼獎。頒獎前夕，謝曉亮教授應美國著名雜志美國醫學會雜志（THEJOURNALOFTHEAMERICANMEDICALASSOCIATION，JAMA）的邀請，發表了有關單分子技術與基因組學的評述，并對這兩個領域與蓬勃興起的精準醫學的關系作了詳細介紹。2014年，兩個健康的試管嬰兒來到人世，被視為“帶動”單分子生物學技術的一大進步。因為他們的健康有賴于出生前一項單分子層面的檢測技術，該技術讓他們減少了攜帶父母體內的遺傳病基因的可能。這對于防患遺傳病和整個生物醫學都意義重大。在單分子生物學研究領域作出這樣的技術創新，并將其應用于試管嬰兒遺傳性疾病的預防，正是謝曉亮成為首個阿爾伯尼獎華人科學家得主的原因。不過，如此重要的單分子生物學還是一個年輕的學科。謝曉亮在最新發表于JAMA的文章中介紹，在過去20年里,單分子成像與操縱領域的進展迅速，孕育出一門基于觀測單個分子理解生物過程的新學科單分子生物學。在全世界許多實驗室的推動下，這個嶄新的領域改變了我們對于許多生物學問題的思考與理解，并產生出很多新知識。結緣單分子謝曉亮與單分子生物學緣起于上個世紀90年代初。謝曉亮帶著在室溫下單分子成像的想法進入美國西北太平洋國家實驗室，成為該實驗室第一位中國籍科學家。1998年，謝曉亮的研究組在科學上發表了對膽固醇氧化酶催化的研究（圖1），這是一個單分子生物學的早期經典案例。膽固醇催化酶所含有的核黃素輔基在氧化態下是天然發光的熒光基團，而在還原態下則不發光，所以每一次熒光的“亮/滅”循環對應著一個酶分子催化狀態的翻轉。這一特點使得對單個酶分子反應的實時觀測成為可能。“在單分子層面上，化學反應是隨機發生的，即化學反應發生所需的等待時間是隨機分布的，而不像在擁有大量分子系統中的反應那樣有可被推測的結果。由于很多生物大分子，例如DNA，是以單分子或者少量幾個分子的形式存在于細胞之中，故能對單分子化學反應進行實時觀察就尤為重要。”謝曉亮在上述最新文章中表示。圖1單個膽固醇氧化酶分子E的熒光信號顯示出酶反應發生時氧化態核黃素（FAD，發熒光）和還原態核黃素（FADH2，不發光）狀態之間的轉換是隨機的。對膽固醇氧化酶催化的研究成果奠定了單分子酶學領域發展的基礎，謝曉亮也成為該領域的奠基人。謝曉亮在前述文章中指出，單分子酶學具有實際應用意義。例如，單分子測序儀可以監測單個DNA聚合酶分子將有熒光標記的核苷酸逐個合成到一個單鏈DNA模板上的過程，從而直接讀取DNA分子的序列。盡管單分子測序儀目前在成本、準確性和通量方面尚不能與基于大量分子的DNA測序儀相競爭，但它具有一個獨特的優勢能夠對很長的DNA序列進行測序。“2007年以來基于大量分子（還不是單分子）的新一代DNA測序儀的出現，已開啟了激動人心的個體化醫療的新紀元。”謝曉亮說。開創新領域在基礎研究領域，單分子生物學不僅在體外而且在活細胞內增進了人們對許多大分子系統工作機理的深入理解。繼單分子酶學之后，謝曉亮又開創了活細胞中的單分子研究。謝曉亮解釋說，一個基因在單個細胞中只有一個或者兩個拷貝，基因表達的過程和單個酶分子反應一樣，也是隨機發生。因此，單分子生物學與單細胞生物學是密切相關的。近年來，謝曉亮的研究團隊對單個活細胞中MRNA和蛋白質分子逐個產生的隨機過程進行了詳細的研究，從而使得分子生物學的“中心法則”在單分子層面上得到了定量的描述。2006年，其在自然和科學發表論文，首次介紹在活細胞中逐個觀察基因表達的方法，該方法讓科學家們能夠以前所未有的方式在單分子層面上研究基因調控。DNA以單分子（單個染色體）的形式存在于每一個人體細胞中，所以基因組的變化也是隨機發生的。相應地，人類生殖細胞分裂時發生的隨機重組使得每一個細胞都不相同，比如癌細胞中劇烈的基因組變化也使得原發腫瘤中的細胞之間存在高度的異質性。在一個細胞中，最常見的基因組改變包括單核苷酸變異（SNV，一種單堿基對的點突變）和基因拷貝數變異（CNV）。謝曉亮在文中介紹，在人類整個基因組的六十億個堿基對中，任何一個特定的SNV便可能導致遺傳性疾病；CNV則通常發生在生殖細胞分裂時的染色體分離過程中以及腫瘤細胞內基因組的重排錯誤（包括插入、缺失、染色體倒位和易位）。“由于SNV和CNV在不同細胞中的發生是隨機的、不同步的，因此每個細胞都擁有不同的基因組，這使得單細胞測序成為必需。而直到最近，由于單細胞基因組學的發展，這種必需才變得可行。”他說。專注精準醫療約7000種單基因遺傳疾病會嚴重影響人類健康，并對病人家庭和社會醫療體系產生沉重負擔。例如染色體異常，即染色體層面上的拷貝數變異，是流產及許多遺傳性疾病如唐氏綜合癥的主要致因。如果能夠提前發現這些不好的基因變化，那么將減少人們受到病痛的折磨的幾率。這些讓單細胞基因檢測成為被需要的技術。給單個人類細胞做全基因組測序需要對其進行全基因組擴增（WGA）（圖2）。謝曉亮研究組于2012年發表在科學的一篇文章，介紹了他們研發的一種新方法。這種方法被稱為“多重退火循環擴增法”（下文簡稱MALBAC）。相比之前被廣泛應用的MDA方法，MALBAC能夠更準確地檢測SNV和CNV，在人體細胞中數字化地計數一個基因的拷貝數,并且能夠沒有假陽性地檢測單個SNV，雖然仍可能會有一定的假陰性。圖2單細胞的全基因組擴增（WGA）過程。謝曉亮在北京大學生物動態成像中心的團隊與該中心的湯富酬團隊、白凡團隊、北醫三院的喬杰團隊以及北京腫瘤醫院的王潔團隊合作，成功地把MALBAC用于協助人工輔助生殖和癌癥的研究。“把MALBAC用于協助人工輔助生殖和癌癥的研究，兩者皆對精準醫學有著重要意義。”謝曉亮在上述文章中說。在人工輔助生殖領域，為了避免染色體異常和單基因疾病的遺傳，MALBAC已經被應用于胚胎植入前基因組篩查PGS和胚胎植入前遺傳學診斷PGD圖3。謝曉亮介紹說，雖然PCR、熒光原位雜交（FISH）和DNA微陣列芯片等方法都已經被用于PGD和PGS，MALBAC能夠提供更高的精確度，并可以同時避免染色體異常和危險點突變的發生。2014年，兩個“MALBAC嬰兒”的出生得到了大量的關注和報道，并在國際學術界引起反響。在這兩個案例中，研究人員成功地利用了MALBAC來篩選健康胚胎，使嬰兒基因組中避免帶有父母中一方所攜帶的遺傳疾病基因。MALBAC極低的假陽性和假陰性率完美地滿足了兩個嬰兒的父母希望后代不再攜帶嚴重的雜合致病突變的要求。這為那些患有遺傳性疾病或攜帶遺傳疾病基因的夫妻帶來了福音。圖3人工輔助生殖體外受精植入前基因篩檢PGS示意圖（只顯示一對染色體）。來自父親（綠色）和母親（紅色）的染色體DNA發生過同源重組。受精后，胚胎發育不需要的第一和第二極體（卵細胞上方的兩個小圓球）可以通過一個微細移液管取出，利用MALBAC方法進行WGA。對這兩個極體或胚胎囊胚期的少數細胞進行測序，染色體異常（最上面）可以被避免，同時還可以檢查出帶有疾病基因的點突變（中間），從而增加健康嬰兒植入的成功率（下面）。“類似的方法可以減少某些疾病，如乳腺癌在下一代中的遺傳風險。”謝曉亮在文章中指出，選擇一個風險較低的等位基因，如特定的BRCA基因序列，在技術上目前是可行的，但在倫理層面上還需要進一步討論。據了解，謝曉亮與其團隊也正在努力嘗試將MALBAC技術應用于癌癥的診斷。眾所周知，癌癥是一種基因組疾病。循環腫瘤細胞CTC在進入人體外周血液循環后可能介導癌細胞的轉移，并引發90與癌癥相關的死亡。而謝曉亮等人研究發現循環腫瘤細胞與原發腫瘤細胞有所不同。他們使用MALBAC分析肺癌患者的單個循環腫瘤細胞基因組，發現其循環腫瘤細胞的CNV模式在一個病人體內以及在患同一種癌癥的不同病人中是相似的，但在不同的癌癥類型中是截然不同的。此外，這些循環腫瘤細胞中重復出現的CNV模式與患者的轉移灶腫瘤細胞CNV模式也是一致的。在上述文章中，謝曉亮指出，“顯然,染色體特定區域拷貝數的增減模式被腫瘤轉移所選擇。循環腫瘤細胞的CNV模式與癌癥類型有關這一發現為研究人員提供了基于CNV模式進行無創癌癥診斷的可能。因此，單細胞全基因組擴增方法的進一步發展將有助于科學家能夠更好地了解腫瘤異質性和癌癥轉移的機制，而且有望實現對癌癥的精準化診療。”謝曉亮在文章的最后強調了自己的核心觀點，DNA以單分子的形式存在于每個細胞中，因此基因表達和基因組的變化是隨機發生的，這也使得在單細胞和單分子水平上的測量成為必需。“單細胞基因組學發端于單分子技術與基因組學的交匯之處。”展望未來，謝曉亮寫道，“在單細胞中進行精確基因拷貝數的計數以及基因點突變的檢測現在不僅已成為可能，而且正在成為日益重要的技術。這些手段使得科學家們能夠在單個分子的層面上檢測、理解并改善生命過程，也成為精準醫學的生動案例。”參考文獻1XIEXSSINGLEMOLECULESMEETGENOMICSPINPOINTINGPRECISIONMEDICINEJAMAPUBLISHEDONLINEMAY14,2015DOI101001/JAMA201555332LUHP,XUNL,XIEXSSINGLEMOLECULEENZYMATICDYNAMICSSCIENCE19982825395187718823ZONGC,LUS,CHAPMANAR,XIEXSGENOMEWIDEDETECTIONOFSINGLENUCLEOTIDEANDCOPYNUMBERVARIATIONSOFASINGLEHUMANCELLSCIENCE2012338611416221626書是我們時代的生命別林斯基書籍是巨大的力量列寧書是人類進步的階梯高爾基書籍是人類知識的總統莎士比亞書籍是人類思想的寶庫烏申斯基