第 章 DNA的生物合成和修復 第一節 DNA 復 制 核酸鏈的合成方向只有一個：53。在DNA復制過程中，DNA雙螺旋的兩條鏈可以同時作為模板；但是在轉錄時，DNA雙鏈中往往只有1條鏈能夠作為模板鏈，也有個別例外。RNA聚合酶能夠從頭合成1條新的RNA鏈，而DNA聚合酶則需要RNA引物，它不能從頭合成1條DNA鏈。 染色體DNA復制的共同特征有：半保留復制。形成復制叉結構。雙向復制。半不連續復制。復制起點具有特殊序列。需要RNA引物。復制的高度忠實性。-DNA復制時，1條鏈的合成方向和復制叉的前進方向相同，可以連續復制，這條鏈叫作前導鏈(1eading strand)；-而另一條鏈的合成方向和復制叉的前進方向正好相反，不能連續復制，只能分成幾個片段合成，故稱之為滯后鏈(1agging strand)。-滯后鏈片段叫作岡崎片段，它們合成后再連接起來。 -DNA鏈不能從頭合成。在DNA復制開始時必須先合成一小段RNA作為引物(primer)，從它的3羥基開始合成DNA鏈，這一過程叫作引發(priming)。- 三、E.coli的DNA復制 (一)復制的起始 oriC的9bp區富含A和T，DnaA蛋白的結合使這一區域容易解鏈(melted)，并形成復制起始的開放型復合物(open complex)，這個過程消耗ATP。dnaC蛋白將dnaB蛋白運送到指定位置解旋酶 DnaB蛋白介導E.coli的染色體DNA必須進一步解旋。復制開放復合物中的每1條單鏈上各有1個解旋酶分子結合。而形成預引發復合物(prepriming complex)。 *Ecoli的SSB蛋白結合于DNA單鏈區，以防止DNA再退火(reannealing)，此外，SSB蛋白可以防止形成局部發夾式螺旋阻礙DNA聚合酶前進。 (二)引發 DNA復制都需要引發酶合成RNA引物。這些RNA引物5，端第1個核苷酸通常是pppA，個別為pppG，其長度從幾個核苷酸(45個)到十幾個不等，它們的前12個核苷酸往往是固定的，后面的可以是任意的核苷酸，也可能從DNA模板鏈上拷貝。 -引發酶、DnaB和幾種蛋白因子形成的復合物叫作引發體(primosome)，它能沿著結合了SSB蛋白的DNA單鏈定向運動，并在不同位點合成RNA引物。 (三)半不連續復制在E.coli復制叉，前導鏈的連續合成比較簡單。滯后鏈合成分段進行，需要合成若干RNA引物，DNA聚合酶可以在RNA引物的3端開始合成罔崎片段(Okazaki fragments)，在細菌和噬菌體中它的長度一般為1 0002 000個核苷酸，但在真核細胞中只有100200個核苷酸。當每個新合成的罔崎片斷3端到達相鄰的另1個罔崎片段的5端時，DNA聚合酶I利用其53，外切酶活性切除后者5端的RNA引物，同時利用它的DNA聚合酶活性填補兩個罔崎片段之間的缺口。然后，另1個關鍵酶DNA連接酶(1igase)將相鄰的這兩個罔崎片段的3羥基和5磷酸基團連接起來。 DNA聚合酶I，從N端到C端有3個酶促活性結構域依次排列： 53外切酶和35外切酶和DNA聚合酶。在DNA損傷修復時，DNA聚合酶I對于填補缺口(gapfilling)可能是最重要的酶。 DNA聚合酶兼有35外切酶和DNA聚合酶活性。DNA聚合酶能夠在DNA的兩條鏈在同一部位都發生損傷時進行DNA修復。 只有DNA聚合酶符合E.coli體內DNA復制的要求,DNA聚合酶在E.coli的DNA復制中是主要的DNA合成酶。 DNA聚合酶亞基具有DNA聚合酶活性，而亞基具有35為外切酶活性，它對于校正功能十分重要。亞基可能起組裝作用。其他7種亞基的主要功能是，將核心聚合酶從分配型酶(distributive enzyme)轉變成持續型酶(processiye enzyme)。 DNA聚合酶之所以具備持續合成能力，亞基二聚體起了關鍵作用，它的主要功能是防止核心聚合酶在DNA復制過程中從模板鏈上掉下來。 (四)復制的終止位點和Tus蛋白E.coli的兩個復制叉的匯合點就是復制的終點，在復制叉匯合點兩側約lOOkb處各有1個終止區(terD，A和terC，B)，它們是向1個方向運動的復制叉特異的終止位點(TER sites)， 4個ter序列中都含有1個23bp的共有序列， Tus蛋白(36Kd)識別和結合于終止位點的23bp共有序列，它具有反解旋酶(contrahelicase)的活性，以阻止DnaB蛋白的解旋作用，從而抑制了復制叉的前進。 -復制體(replisome)是在復制叉形成的1種多蛋白復合物，其中包括DNA聚合酶等酶和蛋白因子，它的功能是促使DNA復制。 四、真核細胞的DNA復制 在哺乳動物細胞中發現了5種DNA聚合酶()。哺乳動物的DNA聚合酶和分別負責合成滯后鏈和前導鏈，和可能和DNA損傷修復有關，而負責合成線粒體DNA (二)端粒和端粒酶 真核生物線性染色體的末端具有特殊結構端粒(telomeres)。端粒由特異的寡聚核苷酸重復序列組成, 端粒不僅對于染色體的穩定性十分重要，而且為染色體DNA復制所必需。-端粒酶(telomerase)，它是1種核糖核蛋白(RNP)，可以利用自己的RNA分子作為模板，從3端合成并延長滯后鏈模板DNA。一旦滯后鏈模板的3端延伸到足夠長，就可以完整地合成滯后鏈的最后1個岡崎片段，產生完整的子染色單體。 某些基因組的DNA復制特征和原核或真核生物的染色體DNA復制明顯不同，例如線粒體DNA的D環(D-Loop)復制和噬菌體的滾環(rolling circle)復制。 DNA復制的高度忠實性有賴于多種因素，包括RNA引物的作用，DNA聚合酶的自我校正功能，幾種校正和修復系統，以及DNA本身的結構特征(T取代U)等， (二)錯配校正系統 E.coli的錯配校正系統利用dam基因編碼的甲基化酶(methylase)，將DNA所有的 GATC序列中的A在N6位甲基化，新合成的DNA鏈中的A要晚一些時候才被甲基化。這就為區別新DNA鏈和模板鏈提供了基礎。 E.coli的錯配校正過程始于三種蛋白發揮作用，它們是Mut S，Mut L和Mut H。Mut S可以識別和結合于DNA的錯配堿基處,Mut H在新DNA鏈(尚未甲基化)的GATC的5側造成缺口(nick)，而MutL將MutS和MutH連結在一起，從而使新合成的DNA鏈和模板鏈形成環狀結構(looping)。然后，在DNA解旋酶和SSB蛋白等因子參與下，核酸外切酶I切除新DNA鏈上包括錯配堿基在內的片段。最后，由DNA聚合酶和連接酶完成修復。 真核生物新合成的DNA鏈上往往帶有缺口，這種單鏈DNA缺口本身就是1個信號，可以指導在真核細胞中進行正確的錯配校正。 七、拓撲異構酶topo I可以在雙螺旋DNA中的1條鏈上造成缺口，于是缺口兩側的DNA就能夠以缺口對面的磷酸基團為中心自由旋轉，旋轉方向取決于DNA雙螺旋中的張力，使張力得以釋放。E.coli的topo 只作用于負超螺旋DNA，消除負超螺旋，它對正超螺旋DNA不起作用。而真核細胞的topo I能夠使正或負超螺旋都消除。topo可以同時共價結合于DNA的兩條鏈，并將兩條鏈暫時切斷，再重新連接。在復制叉前進時，E.coli的topo可以將前方產生的正超螺旋轉變為負超螺旋。此外，它還能在DNA雙螺旋中引入負超螺旋， 在E.coli中還有1種第二類DNA拓撲異構酶topo，它的功能是將復制產生的兩個子染色體從連環體(catenanes)中分離出來。所有的第二類DNA拓撲異構酶都催化連環 (catenation)和去連環(decatenation)過程第二節 DNA的損傷修復 環境的物理或化學因素給細胞中的DNA帶來的損傷有以下幾種類型： (一)堿基丟失 (二)堿基改變 (三)核苷酸插入或缺失 (四)DNA鏈斷裂 (五)DNA鏈間共價交聯。 二、DNA損傷的幾種修復機制 (一)直接修復(directrepair) (二)切除修復(excisionrepair) (三)重組修復(recombinational repair) (四)DNA的傾向差錯合成和SOS反應 切除修復可以分為以下3種方式：堿基切除修復。核苷酸切除修復。堿基錯配修復(校正)，第三節 逆 轉 錄 - 所謂逆轉錄，是指在逆轉錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。 逆轉錄酶兼有三種