.,1,體內藥物分析的樣品處理和方法學驗證,.,2,1.為什么要對生物樣品進行處理？2.有哪些生物樣品？3.有哪些樣品處理方法？各自的特點。4.如何對分析方法進行驗證？5.有哪些參考標準？,.,3,生物樣品進行前處理的目的在于：1藥物進入體內后，經吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體液、組織和排泄物中除了游離型（原型）藥物之外，還有藥物的代謝物、藥物與蛋白質形成的結合物、以及藥物或其代謝物與內源性物質，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯綴合物等多種形式存在，需要分離后測定藥物及代謝物。,一、處理的目的,.,4,2生物樣品的介質組成比較復雜。如在血清中既含有高分子的蛋白質和低分子的糖、脂肪、尿素等有機化合物，也含有Na、K、Cl-等無機化合物。這些成分會嚴重影響測定的準確性和靈敏度，同時會污染儀器。因此，為了保護儀器，提高測定的靈敏度，保證檢測結果的準確性和可靠性，必須對樣品進行前處理。,.,5,60%以上精力和花費用在樣品前處理上,.,6,生物樣品包括各種體液和組織，但實際上最常用的是比較容易得到的血液（全血、血漿、血清）、尿液、糞便、唾液。在一些特定的情況下選用乳汁、腦脊液等。,二、生物樣品的種類,.,7,全血不易保存，且血細胞中含有更多的干擾物質，影響測定，故很少采用全血測定藥物濃度。僅適用于血漿藥物濃度太低或者血漿藥物濃度波動大，且難以控制的藥物如：環孢霉素A。,1全血,.,8,測定血中藥物濃度通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細胞的全血中的藥物濃度。將采取的血液置含有抗凝劑（如：肝素、EDTA）的試管中，混合后，3000至4000r/min離心，分離血細胞，上清液即為血漿。,2血漿,.,9,血漿中含有的物質種類和比例,.,10,血清是在采血后不加任何抗凝劑，于室溫下靜置15-30min，待其自然凝結后，離心，分離出上清液。血清顏色較血漿更淺，成分較血漿少了大部分的纖維蛋白，更易進行處理，且血漿及血清中的藥物濃度測定值通常是相同的。,3血清,.,11,一般認為，當藥物在體內達到穩定狀態時，血漿中藥物濃度與藥物在作用點的濃度緊密相關，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標。血漿和血清可以穩定的冰凍保存，一般儲存在-20的條件，長期保存時可以保存在-80的條件下，是生物樣品檢測中最常用的樣本。,.,12,尿液主要成分是水、尿素及無機鹽類。尿樣采集后，為了保存，常會加入防腐劑。體內藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型或代謝物及其綴合物等形式排出。尿液中藥物濃度較高，但尿液濃度受尿量的影響，通常變化較大，應測定一定時間內排入尿中藥物的總量。,4尿液,.,13,唾液中所含成分比較簡單，且容易獲得，但是只有少數藥物的唾液濃度和血漿游離藥物濃度具有相關性，實際使用不多，當藥物血漿結合率高的時候，唾液中藥物的濃度極低，很難檢測。,5唾液,.,14,采樣后除立即分析外，為防止藥物發生變化，應：短期保存，可4冷藏；長期保存，可-20冷凍，不要反復凍融，必要時可以加入酶抑制劑和抗氧化劑。,生物樣品的保存：,.,15,主要應考慮生物樣品的種類，被測藥物的性質和測定方法三個方面的問題。,三、常用的處理方法,1.沉淀蛋白PPT2.液液萃取LLE3.固相萃取SPE,.,16,1.沉淀蛋白,有機溶劑沉淀法加入水溶性的有機溶劑，可使蛋白質的分子內及分子間的氫鍵發生變化而使蛋白質凝聚。常用的有機溶劑有：乙睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。血漿或血清與有機溶劑的體積比為1:3時，就可以將90%以上的蛋白質除去，采用低溫高速速離心機16000r/min離心10min便可將析出的蛋白質完全沉淀。,.,17,實際應用中，多是取50uL的血漿，加入500uL的有機溶劑，渦旋離心后，取上清進樣；若沉淀后，信號相應不好，可嘗試更換有機溶劑或者在沉淀時，加入酸或堿，調節pH值，可能會對結果影響很大；常用的酸堿有：鹽酸，甲酸，乙酸，氨水等。,.,18,優點：操作簡單，為方法開發中最先考慮使用的。缺點：只使用于樣品中濃度較高的藥物測定；且處理后，樣品中仍然會存在很多干擾物質，對結果產生干擾；殘余的雜質會堵塞色譜柱，污染儀器。,.,19,中性鹽能將與蛋白質水合的水置換出來，從而使蛋白質脫水而沉淀。常用的中性鹽：飽和硫酸胺、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等。鹽析的方法與有機溶劑提取法常并用，藥物的回收率較高。,加入中性鹽,.,20,20,加入強酸,當pH低于蛋白質的等電點時，蛋白質以陽離子形式存在，加入強酸，可與蛋白質陽離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強酸有：10%三氯醋酸等。血清與強酸的比例為1:0.6混合，高速離心,就可除去蛋白質。在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。,.,21,當pH高于蛋白質的等電點時，金屬陽離子與蛋白質分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有：CuS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含藥物血清與沉淀劑的比例為1:2混合，高速離心、分離后得上清液。,加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑,.,22,在測定一些酸不穩定及蛋白結合牢的藥物時，常需用酶解法。在測定尿中的藥物濃度時，由于尿中藥物主要以綴合物的形式排除，較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取，常用酶水解的方法。,酶解法,.,23,超速離心法平衡透析法最主要的應用在測定血漿中游離的藥物濃度和藥物的血漿蛋白結合率。,其他的一些去除蛋白質的方法：,.,24,藥物在體內吸收，需經跨膜轉運，所以多數藥物具有一定的脂溶性，而生物樣品中大多數內源性雜質是強極性的水溶性物質，所以可以根據藥物分子與基質之間極性的差異，使用適當的有機溶劑提取藥物，有機溶劑提取可一次除去大部分雜質。,2.液液萃取法LLE,.,25,有機溶劑應選擇穩定，易揮發，低毒性，不與水相混溶的溶劑。常用的有機溶劑有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。應用本法時需要考慮所選有機溶劑的特性、藥物的特點、有機溶劑相和水相的體積比及水相的pH值等。酸性藥物的解離：AH+H2OA-+H+堿性藥物的解離：B+H2OB+OH-藥物的解離常數pKa為藥物解離50%時溶液的pH值。,.,26,藥物的提取程度主要取決于水相的pH值。對于堿性藥物，最佳pH值要高于pKa1-2個單位；對于酸性藥物來說，則要低于pKa值1-2個單位；這樣就可使90%的藥物以非電離的形式存在從而更易溶于有機溶劑中。常用來調節pH值的物質有：甲酸、乙酸、鹽酸或氨水、氫氧化鈉等。水相的PH值-影響液液萃取最關鍵的因素,.,27,具體的提取模式有兩種，直接提取和反提取法。優點：樣品經過提取后，可除去大部分雜質，比較“干凈”；對有機溶劑蒸發后復溶，可以對樣品進行濃縮；大多數藥物具有脂溶性，應用范圍廣。缺點：費時費力，操作繁瑣；且對血漿進行提取時，血漿中的脂質會一起被提取出，當使用質譜檢測器時，會在離子源處產生基質效應，嚴重干擾質譜檢測結果的準確性！,.,28,方法摸索中，一般是使用以上溶劑，平行操作，同時提取，附加空白對照，比對結果，判斷哪種有機溶劑的提取效果最好；若均不理想，可以再混合使用以上溶劑，調整比例1:1,1:2,1:3的使用；在摸索合適的提取溶劑同時，可根據藥物的酸堿性嘗試著添加些酸、堿或者離子對試劑，提高回收率；提取過程中，一定要嚴控pH值，對于兩性藥物則需要使用緩沖溶液保證提取回收率的穩定可重現。,.,29,舉例：雌二醇的檢測取血漿樣品100uL，+同位素內標20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80冷凍10min，倒出上層有機層，40水浴氮氣吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40水浴孵育20min，+磷酸鹽緩沖液2mL+叔丁基甲醚4mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80冷凍10min，倒出上層有機層，40水浴氮氣吹干，流動相復溶。,.,30,固相萃取(SolidPhaseExtraction，簡稱SPE)是從八十年代中期開始發展起來的一項樣品前處理技術。由液固萃取和液相色譜技術相結合發展而來。主要通過固相填料對樣品組分的選擇性吸咐及解吸過程，實現對樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質干擾，提高檢測靈敏度。,3.固相萃取SPE,.,31,固相萃取的基本原理和方法：SPE技術基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡單的色譜過程。較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，保留其中被測物質，再選用適當強度溶劑沖去雜質，然后用少量良溶劑洗脫被測物質，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質，而讓被測物質流出。,.,32,.,33,萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！,.,34,固相萃取操作一般有五步：活化甲醇/乙腈潤濕小柱，活化填料；平衡水或適當緩沖液沖洗平衡小柱；上樣將樣品轉移上柱，抽去廢液；淋洗水或緩沖液最大程度洗去干擾物；洗脫用小體積的溶劑將被測物質洗脫下來并收集。,.,35,1.正相色譜原理2.反相色譜原理3.離子交換原理,根據原理分類：,.,36,.,37,SPE方法的優點：1.不會發生乳化；2.適用范圍廣；3.提取效率高；4.方便快速，可以一次提取分離多種化合物；5.溶劑消耗少；6.易于實現自動化；7.離子交換固相萃取利用離子交換原理，同色譜柱的依據極性大小的分離原理不同，配合使用，可以最大限度的分離出藥物，去除干擾。目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已經廣泛應用。,.,38,三種方法的比較：,.,39,將藥物進行化學衍生化的目的是：使藥物變成具有能被分離的性質；提高檢測的靈敏度；增強藥物的穩定性；提高對光學異構體分離的能力等。藥物分子中含有活潑H者均可被化學衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團的藥物都可被衍生化。,4.化學衍生化法,.,40,HPLC中化學衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化兩種方法。柱前衍生化分析前盡可能將藥物進行提取分離后再衍生化，防止其他含有相同的功能基團的雜質也被衍生化，影響分離。柱后衍生化是藥物經色譜柱分離之后進行的，所以可形成對檢測器具有高靈敏度的衍生物。HPLC法常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹磺酰氯、熒胺等。,.,41,定量下限達10pg級別！,.,42,待測藥物的理化性質及在生物體內的存在狀況分析測定的目的與要求生物樣品的類型與預處理方法實驗室條件,體內藥物分析方法的建立,.,43,1.光譜分析法2.色譜法3.毛細管電泳法4.免疫分析法5.同位素法,體內藥物分析方法大致可歸為一下幾類：,.,44,體內藥物的HPLC-MS/MS分析方法開發的一般流程：,1.查閱相關文獻資料，了解藥物的理化性質，選定內標物質；2.使用標準品，掃描質譜條件；3.選擇色譜柱和流動相，摸索合適的液相條件；4.依據樣品基質，配制模擬生物樣品，選擇相應的樣品處理方法，處理后進樣分析；5.調整樣品處理方法或液相條件，并可進一步優化質譜參數；6.根據檢測目的，設定定量范圍，對方法進行考察。,.,45,方法學驗證（validation）,生物樣品測定的關鍵是方法學的確證。方法學確證是整個藥代動力學研究的基礎。這是藥代動力學研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動力學研究結果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結果，因此必須對所建立的方法進行驗證。并且在實際樣品檢測過程中還應進行方法學質控，制備隨行標準曲線并對質控樣品進行測定，以確保檢測方法的可靠性。,.,46,.,47,Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation-EMEA,.,48,.,49,.,50,4.校正曲線Calibrationcurve,結果要求：校正曲線應至少包括六個濃度點以及一個MatrixBlank和一個ControlZero點（僅作參考，不納入校正曲線的計算），必要時可以做雙份測定；各個濃度點的準確度應在85%-115%之間，精密度應小于15%，定量下限處為80%-120%和20%；對不符合要求的濃度點可以排除計算，但至少有75%以上的濃度點符合要求；方法驗證期間應至少提供三條以上的合格的標準曲線納入統計。,.,51,.,52,質控樣品QualityControl，QC,將標準品加入到生物基質中配制成的模擬生物樣品，用作方法學驗證中的考察樣品和樣品測定中的方法學質控。低濃度質控(LowQC)濃度不超過LLOQ的3倍；中間濃度質控(MediumQC)濃度一般為定量范圍的中間濃度；高濃度質控(HighQC)濃度至少為ULOQ的75%。質控樣品推薦由獨立人員一次性配制，進樣分析合格后分裝，冰凍儲存，每次取足夠數量的樣品使用，剩余丟棄。,.,53,.,54,.,55,8.穩定性Stability,8.1分析物和內標的標準貯備液(Stock)和標準工作液(Working)的穩定性8.2樣品冰凍/融三次解穩定性，Freeze/Thaw，F/T8.3樣品融解后短期穩定性，Thawed8.4樣品冰凍的長期穩定性，Long-term8.5處理后樣品溶液在進樣器中的穩定性,.,56,穩定