第七章胺類藥物的分析,芳胺類藥物按結構主要分為：芳烴胺類、脂肪胺類（如：氨基醚類）、芳胺類（如;對氨基苯甲酸酯類）、季胺類、酰胺類藥物（如：磺酰胺類）。,第一節苯乙胺類藥物的分析,一、結構與性質(一)基本結構與典型藥物本類藥物為擬腎上腺素類藥物，共性為具有苯乙胺的基本結構。其中腎上腺素、鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸多巴胺分子結構中苯環的3,4位上都有2個鄰位酚羥基，與兒茶酚類似，都屬于兒茶酚胺類藥物。藥典中收載本類原料藥物近20種，在鑒別、檢查和含量測定等方面具有代表性的藥物供分析用。本類藥物的基本結構為：苯乙胺類典型藥物P129,(二)主要化學性質1.弱堿性本類藥物分子結構中具有烴氨基側鏈，其氮為仲胺氮，故顯弱堿性。其游離堿難溶于水，易溶于有機溶劑，其鹽可溶于水。2.酚羥基特性本類藥物分子結構中具有鄰苯二酚（或苯酚）結構，可與重金屬離子絡合呈色，露置空氣中或遇光、熱易氧化，色漸變深，在堿性溶液中更易變色,與三氯化鐵作用顯色。3.光學活性多數藥物分子結構中具有手性碳原子，具有旋光性，可供分析用。此外，藥物分子結構中苯環上的其它取代基，如鹽酸克侖特羅的芳伯氨基，也各具特性均可供分析用。還可利用其紫外吸收與紅外吸收光譜進行定性或定量分析。,二、鑒別試驗(1)與三氯化鐵反應-酚羥基腎上腺素和鹽酸去氧腎上腺素等藥物的分子結構中具有酚羥基，與Fe3+離子絡合顯色，加入堿性溶液，隨即被高鐵離子氧化而顯紫色或紫紅色。見表7-1。(2)與甲醛硫酸反應腎上腺素和鹽酸去氧腎上腺素等藥物可與甲醛在硫酸中反應，形成具有醌式結構的有色化合物。見表7-1。(3)氧化反應-酚羥基本類藥物分子結構中多數具有酚羥基，易被碘、過氧化氫、鐵氰化鉀等氧化劑氧化而呈現不同的顏色。如腎上腺素在中性或酸性條件下，被碘或過氧化氫氧化后，生成腎上腺素紅，放置可變為棕色多聚體；,鹽酸異丙腎上腺素在偏酸性條件下被碘迅速氧化，生成異丙腎上腺素紅，加硫代硫酸鈉使碘的棕色消退，溶液顯淡紅色。重酒石酸去甲腎上腺素在上述條件下比較穩定，幾乎不被碘氧化。為了與腎上腺素和鹽酸異丙腎上腺素相區別，中國藥典規定本品加酒石酸氫鉀飽和溶液（pH3.56）溶解，加碘試液放置5分鐘后，加硫代硫酸鈉試液，溶液為無色或僅顯微紅色或淡紫色。在此條件下腎上腺素和鹽酸異丙腎上腺素可被氧化產生明顯的紅棕色或紫色。在pH6.5的緩沖液中，這三種藥物均可被碘氧化產生紅色。故在pH6.5條件下加碘試液，無法區別這三種藥物。（4）與硫酸銅顯色反應氨基醇結構，可與硫酸銅及氫氧化鈉試液作用生成紫色銅絡合物，該絡合物不溶于乙醚。醚層不顯色。（5)紫外特征吸收與紅外吸收光譜P129紫外吸收光譜P129表72紅外吸收光譜鑒別薄層色譜鑒別,三、雜質檢查(一)酮體檢查腎上腺素、重酒石酸去甲腎上腺素、鹽酸去氧腎上腺素、鹽異丙腎上腺素藥物都是經過酮體還原得到，尚有部分未的酮體雜質。P130(二)有關物質檢查-參閱教材P131四、含量測定本類藥物的原料多采用非水溶液滴定法和溴量法測定含量，其制劑的測定方法較多，有提取容量法、陰離子表面活性劑滴定法、比色法、紫外分光光度法和高效液相色譜法等。,(一)非水溶液滴定法p131在列舉的13種典型藥物中，有10種藥物的原料藥均采用非水溶液滴定法測定含量。常用的測定條件為：冰醋酸為溶劑，加入醋酸汞試液以消除氫鹵酸的干擾，并用結晶紫指示液指示終點。僅鹽酸甲氧明測定中以萘酚苯甲醇指示終點；鹽酸苯乙雙胍和鹽酸克侖特羅的測定采用電位滴定法。如堿性較弱，終點不明顯可加入醋酐，提高其堿性，使終點突躍明顯。1.重酒石酸去甲腎上腺素的測定取本品0.2g，精密稱定，加冰醋酸10ml，振搖溶解后(必要時微溫)，加結晶紫指示劑1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍綠色，并將滴定結果用空白試驗校正。每1ml的高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當于31.93mg的C8H11NO3.C4H4O6。,由于重酒石酸在冰醋酸溶液中酸性較弱，不干擾高氯酸的滴定和結晶紫指示劑終點顏色的變化。故可以高氯酸直接滴定。2.鹽酸克侖特羅的測定取本品約0.25g，精密稱定，加冰醋酸20ml，微熱使溶解，放冷，加醋酸汞試液5ml，照電位滴定法，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并將滴定結果用空白試驗校正。每1ml的高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于31.37mg的C12H18Cl2N2OHCl。*醋酸汞的作用-消除氫鹵酸的干擾。*為何用電位法指示終點？-由于鹽酸克侖特羅的游離堿堿性較弱，終點突躍不明顯。,3.硫酸沙丁胺醇的測定取本品約0.4g，精密稱定，加冰醋酸10ml，微熱使溶解，放冷，加醋酐15ml和結晶紫指示液1滴用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并將滴定結果用空白試驗校正。每1ml的高氯酸滴定液（0.1mol/L）相當于57.67mg的（C13H21NO3)2H2SO4。有機堿的硫酸鹽，因硫酸在滴定液中酸性很強，只能滴定至HSO4-。*為何在放冷的條件下加醋酐？-防止氨基被乙酰化，乙酰化物堿性很弱，如為伯氨基的乙酰化物，以結晶紫為指示劑時不能被滴定，用電位滴定法尚可測定，但突躍很小，這樣就會使滴定結果偏低。仲氨基的乙酰化物，以指示劑法和電位滴定法都不能被滴定。但在低溫時可防止乙酰化，所以加冰醋酸溶解樣品后，應在放冷的條件下再加醋酐。(二)溴量法-如測定鹽酸去氧腎上腺素的測定P131,(三)比色法利用藥物分子結構中的酚羥基可與亞鐵離子絡合顯色，測定鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸多巴胺注射液的含量。也可利用分子結構中的芳伯氨基進行重氮化偶合反應顯色，測定鹽酸克侖特羅栓劑的含量。所以比色法也是本類藥物制劑常用的含量測定方法，具有靈敏和簡便的優點。以鹽酸克侖特羅栓的含量測定為例。1.測定原理加氯仿使栓劑基質溶解后，用鹽酸液（9100）提取鹽酸克侖特羅，加亞硝酸鈉試液后，則分子中的芳伯氨基重氮化，在酸性溶液中，與N-(1-萘基)-乙二胺偶合顯色，在500nm波長處進行比色測定。2.測定方法P132(四)腎上腺素的熒光分光光度法-參閱教材P132,(五)高效液相色譜法利用液相色譜的高效分離、高靈敏度和高選擇性的測定方法，不但對本類藥物制劑進行常規分析，而且還廣泛用于本類藥物的臨床藥濃監控和體內藥物動力學研究。鹽酸腎上腺素注射液的含量測定P132,第二節氨基醚衍生物類藥物的分析,本類藥物為N,N二甲基2(二苯基甲氧基)乙胺鹽，典型藥物有鹽酸苯海拉明、茶苯海明及其制劑。一、結構與性質1不穩定遇光、酸可分解，可生成二苯甲酮、二苯甲醇和甲氨基乙醇2堿性含堿性叔胺基，可生物堿沉淀劑反應3水解性分子中醚鍵在酸性溶液中可水解4顯色反應含二苯甲氧結構，與硫酸顯色反應,二、鑒別試驗(一)與硫酸反應顯色苯海拉明分子中具有二苯甲氧基的結構，能與硫酸發生顯色反應，反應機理不明。鹽酸苯海拉明采用此法鑒別。(二)與生物堿沉淀劑反應與三硝基苯酚反應生成結晶性衍生物，測熔點（熔點為128132）(三)水解反應(C6H5)2CHOH鹽酸苯海拉明酸性水溶液水解，生成白色乳濁，加熱煮沸，析出油狀液體，冷卻，凝固成白色蠟狀固體P133(四)與硝酸銀反應形成白色沉淀鹽酸苯海拉明中的鹽酸與硝酸銀反應形成AgCl。(五)儀器分析法紫外紅外分析法鹽酸苯海拉明的UV、IRUV：max253nm和258nm。IR：除苯環及單取代苯的特征吸收外，于2700cm-12400cm-1處有叔胺鹽N-H峰，1115cm-1有醚的C-O峰。,三、雜質的檢查鹽酸苯海拉明的在合成過程，中間體對羥基苯乙酰胺與副產物及水解產物雜質，帶入成品中，采用薄層色譜檢查鹽酸苯海拉明P135四、含量測定鹽酸苯海拉明：原料藥-非水溶液滴定法片劑及其溶出度-酸性染料比色法注射液-陰離子表面活性劑滴定法茶苯海明：原料藥-苯海拉明:非水溶液滴定法;8-氯茶堿:銀量法片劑-高效液相色譜法(一)非水溶液滴定法鹽酸苯海拉明為有機堿的鹽酸鹽，在冰醋酸中加醋酸汞后，可定量地與高氯酸生成苯海拉明的高氯酸鹽。茶苯海明為8氯茶堿的復鹽。其中苯海拉明含量，可在冰醋酸中直接用高氯酸滴定液測定。,(二)銀量法本法用于茶苯海明中8-氯茶堿的含量測定。藥典規定，按干燥品計算，含苯海拉明應為53.055.5；含8-氯茶堿應為44.047.0。1.測定原理利用8-氯茶堿在堿性條件下加熱水解，將有機結合的氯，經水解作用轉變為無機的氯離子，再選用間接銀量法進行測定。測定方法P136(三)酸性染料比色法鹽酸苯海拉明片及其溶出度的測定1.測定原理鹽酸苯海拉明與溴甲酚綠結合成有色的配位化合物，即離子對，此離子對可溶于氯仿中，產生有色的溶液，可在415nm波長處進行比色測定，對照品比較法計算鹽酸苯海拉明的含量，,4)測定法：精密量取對照品溶液與供試品溶液各2ml，分別置分液漏斗中，各加水5ml與溴甲酚綠溶液3.0ml，搖勻，分別精密加氯仿10ml，振搖提取3min，靜置分層后，分別取氯仿液至具塞離心管中離心（250rpm）10min，取澄清的氯仿液，以氯仿為空白，在415nm波長處，于1cm吸收池中測定吸收度，以對照品比較法的計算式計算本品的含量。(四)陰離子表面活性劑滴定法-參閱教材P141(五)高效液相色譜法P136本法分離效能高,可同時測定茶苯海明片中苯海拉明和8-氯茶堿的含量。,第三節芳胺類藥物的分析,一、結構與性質(一)對氨基苯甲酸酯類藥物本類藥物分子中都具有對氨基苯甲酸酯的母體，結構通式：1、典型藥物：苯佐卡因、鹽酸普魯卡因和鹽酸丁卡因等局部麻醉藥。結構為:,鹽酸普魯卡因胺（抗心律失常藥）化學性質與本類藥物很相似，其結構如下：2、主要化學性質1）芳伯氨基特性顯重氮化偶合反應；與芳醛縮合反應；易氧化變色等。2）水解特性含酯鍵（或酰胺鍵）易水解。其水解的快慢受光線、熱或堿性條件的影響。水解產物主要為對氨基苯甲酸（PABA）。3）弱堿性除苯佐卡因外，因其脂烴胺側鏈為叔胺氮原子，故具有弱堿性。因此能與生物堿沉淀劑發生沉淀反應；但在水溶液中不能用標準酸直接滴定，在非水溶劑中能滴定。,4）其它特性本類藥物的游離堿多為堿性油狀液體或低熔點固體，難溶于水，可溶于有機溶劑。其鹽酸鹽均系白色結晶性粉末，具有一定的熔點，易溶于水和乙醇，難溶于有機溶劑。5）羥肟酸鐵反應普魯卡因胺具有芳酰胺基團，可發生羥肟酸鐵反應(二)酰胺類藥物本類藥物均系苯胺的酰基衍生物，其共性是具有芳酰氨基，基本結構為：,1、典型藥物：對乙酰氨基酚（撲熱息痛）等解熱鎮痛藥、鹽酸利多卡因和鹽酸布比卡因等局部麻醉藥及醋氨苯砜抗麻風藥。,2、主要化學性質1）水解后顯芳伯氨基特性芳酰氨基在酸性溶液中易水解為芳伯氨基，并顯芳伯氨基特性反應。水解反應的速度受空間位阻影響：對乙酰氨基酚利多卡因、布比卡因。2）水解產物易酯化對乙酰氨基酚和醋氨苯砜醋酸醋酸乙酯的香味。3）酚羥基特性對乙酰氨基酚(FeCl3)。4）弱堿性利多卡因的脂烴胺側鏈有叔胺氮原子，顯堿性，可以成鹽，與生物堿沉淀劑發生沉淀反應。與三硝基苯酚試液反應生成的沉淀有一定的熔點。5）與重金屬離子發生沉淀反應鹽酸利多卡因和鹽酸布比卡因酰氨基上的氮可在水溶液中與銅離子或鈷離子絡合，生成有色的配位化合物沉淀。此沉淀可溶于氯仿等有機溶劑后呈色。,二、鑒別試驗(一)重氮化偶合反應分子結構中具有芳伯氨基或潛在芳伯氨基的藥物，均可發生重氮化反應，生成的重氮鹽可與堿性萘酚偶合生成有色的偶氮染料。苯佐卡因、鹽酸普魯卡因和鹽酸普魯卡因胺(鹽酸溶液中)+亞硝酸鈉進行重氮化反應；對乙酰氨基酚和醋氨苯砜(鹽酸或硫酸)加熱水解+亞硝酸鈉進行重氮化反應。如鹽酸普魯卡因的鑒別反應如下：,又如對乙酰氨基酚的鑒別方法取本品約0.1g，加稀鹽酸5ml，置水浴中加熱40分鐘，放冷；取0.5ml，滴加亞硝酸鈉試液5滴,搖勻,用水3ml稀釋后，加堿性萘酚試液2ml，振搖，即顯紅色。反應式見教材P119。鹽酸丁卡因結構中的芳香仲胺在酸性溶液中與亞硝酸鈉反應，生成乳白色的N亞硝基化合物沉淀（可與具有芳伯氨基的同類藥物區別）。,(二)與三氯化鐵反應-對乙酰氨基酚（+FeCl3試液藍紫色）。(三)與重金屬離子反應1.與Cu2+和Co2+反應鹽酸利多卡因，在碳酸鈉試液中，與硫酸銅反應生成藍紫色配位化合物，溶于氯仿則顯黃色。（鹽酸普魯卡因、鹽酸丁卡因和苯佐卡因等無此反應）。鹽酸利多卡因，在酸性溶液中與氯化鈷試液反應，生成亮綠色細小鈷鹽沉淀。2.與Hg2+反應鹽酸利多卡因+硝酸汞試液煮沸顯黃色；對氨基苯甲酸酯類藥物顯紅色或橙黃色。3.羥肟酸鐵鹽反應鹽酸普魯卡因胺分子有芳酰胺結構，加入濃過氧化氫溶液，緩緩加熱至沸后，先被氧化成羥肟酸，再與三氯化鐵作用形成配位化合物羥肟酸鐵，溶液顯紫紅色，隨即變為暗棕色至棕黑色。,(四)水解產物反應藥物分子中有些具有酯的結構，在堿性條件下水解，利用其水解產物與試劑的反應進行鑒別。中國藥典用此法鑒別鹽酸普魯卡因、苯佐卡因。1.鹽酸普魯卡因的鑒別方法取本品約0.1g，加水2ml溶解后，加10氫氧化鈉溶液1ml，即生成白色沉淀，加熱變為油狀物（普魯卡因）；繼續加熱，產生的蒸汽（二乙氨基乙醇）能使濕潤的紅色石蕊試紙變為藍色；熱至油狀物消失后（生成可溶于水的對氨基苯甲酸鈉），放冷，加酸酸化，即析出白色沉淀。此沉淀能溶于過量的鹽酸。2.苯佐卡因的鑒別方法取本品約0.1g，加氫氧化鈉試液5ml，煮沸，即有乙醇生成，加碘試液，加熱，即生成黃色沉淀，并發生碘仿的臭氣。,(五)制備衍生物測熔點P141(六)紫外特征吸收光譜P142(七)紅外吸收光譜P142紅外吸收光譜具有特征性強，專屬性好的特點。因此，國內外藥典均把紅外吸收光譜作為一種鑒別方法，而且采用該法鑒別的藥品不斷增加。如中國藥典（1995年版）用紅外吸收光譜法鑒別的藥品，由1990年版的207種增加到316種。該法特別適用于化學結構比較復雜、化學結構相互之間差別較小的藥物的鑒別與區別。因為這些藥物采用其他理化方法難以進行區別，而用紅外吸收光譜法就比較容易區別。以鹽酸普魯卡因的紅外圖譜為例說明。,四、雜質檢查(一)對乙酰氨基酚的雜質檢查合成工藝：A、對硝基氯苯水解對硝基酚還原對氨基酚乙酰化，制得；B、酚亞硝化、還原對氨基酚，乙酰化。在生產過程中除可能引入一般雜質外，還可能引入特殊的雜質。1.乙醇溶液的澄清度與顏色生產工藝中使用鐵粉作為還原劑，可能帶入成品中，致使乙醇溶液產生渾濁。中間體對氨基酚的有色氧化產物，在乙醇中顯橙紅色或棕色。檢查方法取本品1.0g，加乙醇10ml溶解后，溶液應澄清，無色；如顯渾濁，與1號濁度標準液比較，不得更濃；如顯色，與棕紅色2號或橙紅色2號標準液比較,不得更深。,2.有關物質由于本品的生產工藝路線較多，不同生產工藝路線所帶入的雜質也有所不同，這些雜質主要包括中間體、副產物及分解產物。例如：對氨基酚、對氯乙酰苯胺、O-乙酰基對乙酰氨基酚、偶氮苯、氧化偶氮苯、苯醌和醌亞胺等。以對硝基氯苯為原料，可能引入對氯乙酰苯胺，藥典采用薄層色譜法對此項雜質進行限度檢查。檢查方法取本品的細粉1.0g，置具塞離心管或試管中，加乙醚5ml，立即密塞，振搖30分鐘，離心或放置澄清，取上清液作為供試品溶液；另取每1ml中含對氯乙酰苯胺1.0mg的乙醇溶液適量，用乙醚稀釋成每1ml中含50g的溶液作為對照液。吸取供試品溶液200l與對照溶液40l，分別點于同一硅膠GF254薄板上。以氯仿丙酮甲苯（13:5:2）為展開劑，展開后，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視，供試品溶液如顯雜質斑點，與對照溶液的主斑點比較，不得更大，更深。,3.對氨基酚本品在合成過程中，由于乙酰化不完全或貯藏不當發生水解，均可引入對氨基酚，使本品產生色澤并對人體有毒性，應嚴格控制其限量。利用對氨基酚在堿性條件下可與亞硝基鐵氰化鈉生成藍色配位化合物，而對乙酰氨基酚無此反應的特點，與對照品比較，進行限量檢查。檢查方法取本品1.0g，加甲醇溶液（12）20ml溶解后，加堿性亞硝基鐵氰化鈉試液1ml，搖勻，放置30min；如顯色，與對乙酰氨基酚對照品1.0g加對氨基酚50g用同一方法制成的對照液（臨用配制）比較，不得更深(0.005）。,(二)鹽酸普魯卡因注射液中對氨基苯甲酸的檢查普魯卡因分子結構中有酯鍵，易發生水解反應。其注射液制備過程中受滅菌溫度、時間、溶液pH值、貯藏時間以及光線和金屬離子等因素的影響，可發生水解反應生成對氨基苯甲酸和2-二乙氨基醇。其中對氨基苯甲酸隨貯藏時間的延長或高溫加熱，可進一步脫羧轉化為苯胺，而苯胺又可被氧化為有色物，使注射液變黃，療效下降，毒性增加。故中國藥典90年版規定，本品注射液應檢查水解產物對氨基苯甲酸，其限度不得超過1.2。,檢查方法精密量取本品，加乙醇稀釋使成為每1ml中含鹽酸普魯卡因2.5mg的溶液，作為供試品溶液。取對氨基苯甲酸對照品,加乙醇制成每1ml中含30g的溶液,作為對照品溶液。取上述兩種溶液各10l，分別點于含有羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層板上，用苯冰醋酸丙酮甲醇（14:1:1:4）為展開劑，展開后，取出晾干，用對二甲氨基苯甲醛溶液（2對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100ml，加入冰醋酸5ml制成）噴霧顯色。供試品溶液如顯與對照品溶液相應的雜質斑點，其顏色與對照品溶液主斑點比較，不得更深。,五、含量測定(一)亞硝酸鈉滴定法藥物分子結構中具有芳伯氨基或水解后具有芳伯氨基，在酸性溶液中可與亞硝酸鈉反應，可用亞硝酸鈉滴定法測定含量。本法適用范圍廣，常被國內外藥典所采用。本法測定含量的有：苯佐卡因、鹽酸普魯卡因及其片劑，鹽酸普魯卡因胺及其片劑與注射液，醋酸氨苯砜及其注射液。1.原理芳伯氨基藥物在酸性溶液中與亞硝酸鈉定量反應，生成重氮鹽，用永停法或外指示劑法指示反應終點。,2.測定的主要條件重氮化反應的速度受多種因素的影響，亞硝酸鈉滴定液及反應生成的重氮鹽也不夠穩定，因此在測定中應注意以下主要條件：1)加入適量溴化鉀加快反應速度：在鹽酸存在下，重氮化反應的歷程為：整個反應的速度取決于第一步，而第一步反應的快慢與含芳伯氨基化合物中芳伯氨基的游離程度有密切關系。如芳伯氨基的堿性較弱，則在一定強度酸性溶液中成鹽的比例較小，即游離芳伯氨基多，重氮化反應速度就快；反之，則游離芳伯氨基較少，重氮化反應速度就慢。所以，在測定中一般向供試溶液中加入適量溴化鉀（中國藥典規定加入2g），使重氮化反應速度加快。,溴化鉀與鹽酸作用產生溴化氫，后者與亞硝酸作用生成NOBr：HNO2HBrNOBrH2O(1)若供試溶液中僅有HCl，則生成NOCl：HNO2HClNOClH2O(2)由于(1)式的平衡常數比(2)式的約大300倍，即生成的NOBr量大得多，也就是在供試液中NO+的濃度大得多，從而加速了重氮化反應。2)加過量鹽酸加速反應：胺類藥物的鹽酸鹽較其硫酸鹽的溶解度大，反應速度也較快，所以多采用鹽酸。鹽酸的用量按其反應，1mol的芳胺需與2mol的鹽酸作用，但實際測定時往往加入過量的鹽酸，有利于：重氮化反應速度加快；重氮鹽在酸性溶液中穩定；防止生成偶氮氨基化合物，而影響測定結果。,酸度加大，反應向左進行，故可以防止偶氮氨基化合物的生成。若酸度過大，又可阻礙芳伯氨基的游離，反而影響重氮化反應速度。在太濃的鹽酸中還可使亞硝酸分解。所以，加入鹽酸的量一般按芳胺類藥物與酸的摩爾比約為1:2.56。3)室溫（1030）條件下滴定：通常溫度高，重氮化反應速度快；但溫度太高，可使亞硝酸逸失，并可使重氮鹽分解：一般溫度每升高10，重氮化反應速度加快2.5倍，但重氮鹽分解的速度亦相應地加速2倍；所以滴定一般在低溫下進行。由于低溫時反應太慢，經試驗，可在室溫下進行。,4)滴定管尖端插入液面下滴定：重氮化反應為分子反應，反應速度較慢，幫滴定不宜過快。為了避免滴定過程中亞硝酸揮發和分解，滴定時將滴定管尖端插入液面下約2/3處，一次將大部分亞硝酸鈉滴定液在攪拌條件下迅速加入，使其盡快反應。然后將滴定管尖端提出液面，用少量水淋洗尖端，再緩緩滴定。尤其是在近終點時，因尚未反應的芳伯氨基藥物的濃度極稀，須在最后一滴加入后，攪拌15分鐘，再確定終點是否真正到達。這樣可以縮短滴定時間，也不影響結果。3.指示終點的方法有電位法、永停滴定法、外指示劑法和內指示劑法等。藥品標準中多采用永停滴定法或外指示劑法指示終點。,3.指示終點的方法有電位法