Agilent HPLC使用過程中常見問題及解決方法From： /html/47/n-5647.html一、如何處理 HPLC 中的鹽帶來(lái)的問題？很多問題是由于流動(dòng)相含有鹽成分造成的。建議在清洗時(shí)將水加熱后再?zèng)_洗，這樣既可以將鹽溶解的更好，也可以溶解一些脂溶性物質(zhì)，會(huì)減少很多問題的發(fā)生,包括管路堵塞,鹽析出，基線噪音二、安捷倫1100及1200液相泵的日常維護(hù)泵是液相色譜的核心，泵將流動(dòng)相從溶劑瓶輸送到液相流路系統(tǒng)中，并要在高壓下保持流量和壓力的穩(wěn)定。泵的狀態(tài)正常是液相色譜準(zhǔn)確分析的基礎(chǔ)，所以平日一定要重視對(duì)泵的維護(hù)。下面就安捷倫1100/1200液相色譜泵的日常維護(hù)進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹。1. 流動(dòng)相的準(zhǔn)備為了防止顆粒性物質(zhì)對(duì)泵組件的磨損，流動(dòng)相（特別是水相）應(yīng)該新鮮配置并且過濾。上機(jī)前對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行適當(dāng)?shù)某暶摎猓员ＷC更好的在線脫氣和在線混合的效果。2. 比例閥溶劑通道的分配四元泵的比例閥有A、B、C、D四個(gè)通道，建議將鹽溶液接在下面的通道（A或D），將有機(jī)溶劑接在上面的通道（B 或C）上,也就是有機(jī)通道最好在鹽溶液通道的上面。且建議用水定期沖洗所有比例閥通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。3. 過濾白頭的維護(hù)過 濾白頭位于排氣閥內(nèi)，是一種聚四氟乙烯材質(zhì)的微孔過濾芯，用于過濾流動(dòng)相中的微粒，是經(jīng)常需要維護(hù)的地方。當(dāng)系統(tǒng)壓力有異常增高時(shí)，首先需要檢查過濾白頭 是否阻塞了。判斷的方法是：打開排氣閥，以純水作流動(dòng)相，將流速設(shè)為5mL/min，如果泵壓超過10bar，則說(shuō)明過濾白頭需要更換了。對(duì)過濾白頭的預(yù) 防性維護(hù)通?？梢允?2個(gè)月更換1次，更換時(shí)同時(shí)檢查一下過濾白頭前面的密封金墊，如果發(fā)現(xiàn)變形，也應(yīng)及時(shí)更換。 如果過濾白頭更換過于頻繁，則需要認(rèn)真檢查一下流動(dòng)相的品質(zhì)，確保流動(dòng)相上機(jī)前過濾，確保使用了合適的過濾膜。如果流動(dòng)相有長(zhǎng)菌現(xiàn)象，除了配置新的溶劑， 還應(yīng)對(duì)相應(yīng)的溶劑管線和脫氣機(jī)通道進(jìn)行徹底的清洗。4. 柱塞桿與柱塞密封圈的維護(hù)柱塞密封圈套 在柱塞桿上用于隔離泵與外界，工作時(shí)，它和柱塞桿進(jìn)行頻繁的往復(fù)摩擦，使用一段時(shí)間后，會(huì)有一定的磨損，因而密封圈需要定期更換以保證系統(tǒng)的密封性。更換 活塞密封墊時(shí)檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞。柱塞密封圈有反相和正相之分，反相密封圈為黑色，石墨Teflon材質(zhì)；正相呈橘黃色，聚乙烯材質(zhì)，更適用于正相溶劑。1100/1200標(biāo)配的是反相密封圈，正相應(yīng)用時(shí)，需要更換為正相密封圈。鹽溶液對(duì)柱塞密封圈的壽命有著很大的影響，使用有鹽溶液作為流動(dòng)相的體系時(shí)，要注意鹽溶液通道的清洗，千萬(wàn)不能讓鹽溶液在系統(tǒng)中過夜，常常一個(gè)晚上析出的 鹽粒就會(huì)造成系統(tǒng)堵塞，對(duì)泵產(chǎn)生較大的損害。為了延長(zhǎng)密封圈和柱塞桿的壽命，在經(jīng)常使用較高濃度的緩沖鹽溶液的情況下，建議安裝柱塞清洗附件。柱塞清洗的 原理在于：柱塞泵在工作時(shí)，雖然有密封圈密封，但由于毛細(xì)作用，還是會(huì)有一些流動(dòng)相滲入到密封圈與柱塞桿之間。如果流動(dòng)相中有緩沖鹽，當(dāng)柱塞桿壁上的溶劑 揮發(fā)掉后，極細(xì)小的鹽粒留了下來(lái)。這樣的鹽粒就象砂紙一樣磨損著柱塞桿和柱塞密封圈，會(huì)大大降低柱塞桿和密封圈的壽命。柱塞清洗附件是在柱塞桿的中間加入 了一個(gè)可以有水流過的腔體，通過水不斷的流動(dòng)，就可以帶走滲進(jìn)來(lái)的鹽溶液，防止了鹽粒的析出，保護(hù)了柱塞桿和柱塞密封圈。通常我們往柱塞清洗的水里加入 10的異丙醇，可以減小水的張力，便于清洗液流動(dòng)，并且抑制長(zhǎng)菌。但有一點(diǎn)要注意的是，裝有柱塞清洗附件的泵頭，清洗液流量可以很小（如每分鐘幾滴）， 但一定不要讓清洗通道里干涸，如果水流光了，應(yīng)該盡快換上新的溶液。否則會(huì)減少柱塞桿和密封圈的壽命。 5.主動(dòng)閥的維護(hù) 主動(dòng)閥是流動(dòng)相進(jìn)入泵體的門戶。如果我們發(fā)現(xiàn)流量為零，流量不穩(wěn)，或泵壓波動(dòng)特別大，常常都是因?yàn)橹鲃?dòng)閥漏或是堵了。主動(dòng)閥里面裝有一個(gè)小的單向閥芯，我 們將其取下，在異丙醇內(nèi)超聲清洗一下，一般能解決這樣的問題。如果超聲不能解決問題的話，可以更換該閥芯。對(duì)于經(jīng)常使用緩沖鹽體系的用戶，手頭常備一個(gè)這 樣的閥芯是非常有用的，往往可以及時(shí)解決問題，大大的降低停機(jī)帶來(lái)的損失。6出口閥的維護(hù) 出口閥內(nèi)部也有，如果有鹽?；蚱渌s質(zhì)滲入其中，也會(huì)造成出口閥的堵或漏，常常表現(xiàn)為壓力的異常波動(dòng)。通常我們可以用異丙醇或60度左右的熱水沖洗系統(tǒng)，如果無(wú)效，在異丙醇中超聲清洗它常常會(huì)解決這樣的問題。三、保留時(shí)間重現(xiàn)性不好，可能的原因有哪些？保留時(shí)間不重現(xiàn)還會(huì)影響到峰面積的重現(xiàn)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。引起這種現(xiàn)象因素很多，建議檢查以下幾個(gè)方面：- 確認(rèn)流動(dòng)相是新鮮配置的，比例沒有錯(cuò)誤。- 確認(rèn)色譜柱是好的。- 檢查一下溶劑瓶里的溶劑過濾器沒有長(zhǎng)菌，沒有被堵塞。- 如果使用梯度洗脫方法，請(qǐng)確認(rèn)平衡時(shí)間足夠長(zhǎng)。- 仔細(xì)觀察柱前壓的變化，如果壓力穩(wěn)定，就可以判斷泵的系統(tǒng)沒有問題，請(qǐng)更換新的色譜柱試試。- 如果是壓力不穩(wěn)定，一定會(huì)影響保留時(shí)間。四、柱前壓不穩(wěn)定，壓力上下波動(dòng)的常見原因？引起這種故障最常見的原因是泵里有氣泡，建議用以下的方法排除。- 如果系統(tǒng)沒有配置脫氣機(jī)（二元泵），溶劑一定要經(jīng)常超聲脫氣。- 脫氣機(jī)的效率不夠，特別是用甲醇/水的系統(tǒng)最容易發(fā)生?？梢詫，B通道串聯(lián)；C，D通道串聯(lián)用來(lái)延長(zhǎng)脫氣的時(shí)間，效果非常明顯。主動(dòng)閥閥芯污染。 可以將閥芯取下，用甲醇超聲清洗。五、為什么排氣閥里的過濾芯經(jīng)常堵塞？如果是排氣閥里的過濾芯堵塞引起的壓力升高，請(qǐng)仔細(xì)檢查一下?lián)Q下來(lái)的過濾芯。正常情況下，一個(gè)過濾芯可以使用6個(gè)月左右，如果經(jīng)常更換就有問題。- 如果過濾芯的顏色發(fā)黑，說(shuō)明是被柱塞密封墊磨損下來(lái)的碎屑堵塞的，請(qǐng)確認(rèn)流動(dòng)相使用的緩沖鹽的濃度是否太高了，是否使用了柱塞清洗裝置。 緩沖液在泵頭內(nèi)部析出的鹽的結(jié)晶會(huì)加速密封墊的磨損。- 如果過濾芯的顏色是乳白色的，非常干凈。說(shuō)明過濾芯很有可能是被流動(dòng)相污染了。 請(qǐng)檢查一下是否使用了過期的溶劑（水，有機(jī)溶劑），或質(zhì)量不好的溶劑。請(qǐng)馬上更換別的品牌的溶劑或使用純凈水（推薦：娃哈哈純凈水）。如果流動(dòng)相經(jīng)過了濾膜過濾，請(qǐng)確認(rèn)是否使用了正確的，優(yōu)質(zhì)的濾膜。建議先不要使用濾膜過濾流動(dòng)相，看看是否可以解決過濾芯堵塞的問題。- 如果存放緩沖液或水的溶劑瓶不經(jīng)常清洗，該通路會(huì)生長(zhǎng)藻類，藻類會(huì)污染整個(gè)流路系統(tǒng)和脫氣機(jī)的腔體，藻類及其代謝產(chǎn)物也會(huì)堵塞過濾芯。如果發(fā)生了這種情況，建議用60度的熱水清洗溶劑瓶，并用異丙醇清洗整個(gè)管路和脫氣機(jī)。建議一定要用棕色瓶存放緩沖溶液，避光，并且定期清洗溶劑瓶。六、峰面積或峰高重現(xiàn)性不好，偏差大，可能的原因有哪些？如果HPLC系統(tǒng)配有自動(dòng)進(jìn)樣器，這種情況主要是自動(dòng)進(jìn)樣器的問題。- 首先確認(rèn)柱前壓是穩(wěn)定的，保留時(shí)間的重現(xiàn)性好。- 將自動(dòng)進(jìn)樣器的抽樣速度降低到50ul/min以下 (默認(rèn)值是200ul/min)。如果樣品粘度較大，降低抽樣速度可以極大地改善粘度較大的樣品的進(jìn)樣精度。- 如果進(jìn)樣針或針座有輕微的堵塞，對(duì)進(jìn)樣精度的影響也非常大。- 如果是手動(dòng)進(jìn)樣器，請(qǐng)確認(rèn)一定要使用Agilent配的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣針，且進(jìn)樣器的廢液出口要與進(jìn)樣口水平，避免虹吸的影響。如果是滿Loop進(jìn)樣，建議注射5倍Loop的進(jìn)樣體積。七、自動(dòng)進(jìn)樣器的針頭或針座經(jīng)常堵塞，如何處理？- 如果針頭或針座經(jīng)常堵塞，請(qǐng)檢查使用的進(jìn)樣瓶隔墊。質(zhì)量不好和已經(jīng)破損的隔墊易產(chǎn)生很多碎屑。進(jìn)樣時(shí)，這些細(xì)小的碎屑很容易將針頭，針座堵塞。使用Agilent的正規(guī)隔墊并且經(jīng)常更換舊的隔墊就可以避免這類問題。- 如果樣品是經(jīng)過離心處理的，是用針頭吸取上清液進(jìn)樣, 請(qǐng)將針頭進(jìn)樣位置提高。- 如果針頭或針座發(fā)生了堵塞，可以用以下簡(jiǎn)單的辦法處理：通過Chemstation診斷界面的更換針頭，針座的程序?qū)⑵淙∠?，反接到泵的出口，用反吹的辦法將其疏通。 大部分是可以順利解決的。八、紫外檢測(cè)器（DAD，VWD）信號(hào)波動(dòng)大，噪音大，光強(qiáng)度檢測(cè)通不過，如何處理？引起這種問題的因素很多，要一步一步排除，直到找到問題真正原因。- 確定柱前壓穩(wěn)定；溶劑（高純度的有機(jī)溶劑， 水）使用正確，流動(dòng)相脫氣良好；- 檢查檢測(cè)器的氘燈是否已經(jīng)到了使用壽命，是否更換過新的氘燈。- 用異丙醇清洗整個(gè)系統(tǒng)，更換過濾芯，排除污染源。- 清洗流動(dòng)池和有關(guān)的透鏡（需要工程師去現(xiàn)場(chǎng)服務(wù)）九、HPLC出“鬼峰”，如何排除？HPLC出“鬼峰” 大部分發(fā)生在反相體系（甲醇， 乙腈， 水），是溶劑被污染造成的。還有一種原因是進(jìn)樣系統(tǒng)有殘留。- 先運(yùn)行一個(gè)空白梯度洗脫的方法，從100%水過渡到100%有機(jī)溶劑，如果“鬼峰”出現(xiàn)，可以判斷是水被污染了（水中有藻類Algae的污染）。如果是使用純水機(jī)制作的水，這種現(xiàn)象是最常見的。建議用戶更換“娃哈哈” 純凈水。- 進(jìn)樣系統(tǒng)有殘留很容易判斷，建議加強(qiáng)或改善洗針程序，延長(zhǎng)沖洗Loop的時(shí)間。十、如何查看燈的使用時(shí)間或用新燈后如何重置0?在 ChemStation 軟件的“診斷”級(jí)別