-甘露聚糖酶水解酵母細胞壁水解條件的研究摘要： 采用單因素實驗研究了底物濃度、加酶量、反應時間、反應溫度和 pH 值 5 個因素對 -甘露聚糖酶水解酵母細胞壁的影響。在單因素實驗基礎上，通過正交實驗確定了 -甘露聚糖酶水解酵母細胞壁的最佳水解條件為：底物濃度為 8%，加酶量為 55%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH 值 6.0。關鍵詞： -甘露聚糖酶；水解條件；正交實驗；優化Study on optimization of hydrolysis by -mannanasein yeast cell wallAbstract: The effects of five factors on the -mannan enzyme hydrolysis of yeast cell wall, such as thesubstrate concentration, enzyme dosage, reaction time, reaction temperature and pH value, were studied. Theorthogonal test showed that the best optimized hydrolysis conditions were as follow： pH value of 6.0,temperature of 55 , time of 4.5 hours, enzyme dosage of 55%, substrate concentration of 8%.Key words: -mannanase; decompose by protease; orthogonal experiment; optimize-甘露聚糖酶(-mannanase)是一類能夠水解含有甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括異甘露聚糖)的內切水解酶1，廣泛存在于動植物和微生物中，其主要水解產物為單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖2。隨著人們對甘露寡糖生理功能的發現和對自然界中纖維素資源的利用， -甘露聚糖酶的研究和開發進入了一個新高潮，已被廣泛應用于食品、藥品、飼料、造紙、印刷業、印染、紡織、石油開采和生物學研究等領域3-6。目前，-甘露聚糖酶主要用于水解含有-1,4-D-甘露糖苷鍵的魔芋粉、角豆角、瓜兒豆等植物原料以生產甘露寡糖7-8，而利用 -甘露聚糖酶水解酵母細胞壁中-1,6-甘露聚糖制取甘露低聚糖的研究未見詳細報道9。2002年以來我國啤酒產量實現連續五年穩居世界第一，有豐富的酵母甘露聚糖資源。本實驗是利用實驗室保藏的高產 -甘露聚糖酶菌株產生的-甘露聚糖酶水解酵母細胞壁中 -1,6-甘露聚糖來制取甘露低聚糖，通過研究底物濃度、加酶量、反應時間、反應溫度和 pH 值對 -甘露聚糖酶水解酵母細胞壁效果的影響，以確定-甘生物工程7FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期露聚糖酶水解酵母細胞壁獲得甘露低聚糖的最優條件，為今后有效利用啤酒發酵殘渣生產甘露低聚糖提供參考。1 材料與方法1.1 實驗材料酵母細胞壁：自制；高產 -甘露聚糖酶菌株F1-5-10：實驗室保藏。發酵培養基：酵母細胞壁 20 g，KNO31 g，K2HPO43H2O 0.5 g， MgSO47H2O 0.5 g， FeSO47H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH7.47.6。1.2 粗酶液的制備取高產 -甘露聚糖酶菌株(F1-5-10)在發酵培養基中活化，按 10%的接種量接種到 1000 mL 的三角瓶中，搖床培養 (200 r/min)48 h，500 r/min離心5 min，去除雜質，上清液于 9000 r/min、4 離心 10 min，取上清液10。1.3 酶活力的測定標準曲線的繪制：取標準甘露糖水溶液 0、0.05、0.1、0.2、0.3、1.4 mg/mL 各 1 mL 分別置于6 支具塞試管中，各加入 DNS 試劑 1 mL，沸水浴5 min，顯色，然后以流水迅速冷卻，加蒸餾水8mL，以空白液調零，在 540 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。0.9 mL 0.5% (w/v)角豆膠溶液(由 pH 值 7.0的KH2PO4-NaOH緩沖液配制)，50 保溫 5 min，加入 0.1 mL 適當稀釋的酶液，60 水浴 10 min，DNS 法2測還原糖含量。在上述條件下，每 min釋放相當于 1 mol D-甘露糖的還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。2 結果與分析2.1 標準曲線的繪制按照 1.3 方法測得數據繪制標準曲線見圖 1。2.2 粗酶液的酶活由酶活力的定義計算得到粗酶液的酶活為78.59 U/mL。2.3 單因素條件下 -甘露聚糖酶水解效果的研究2.3.1加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響取自制酵母細胞壁 0.8 g，加入到水、酶液中，加入的酶液占總體積的30%、40%、50%、60%和70%。水解 5 h 后，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖2。從圖 2 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細胞壁的過程中，隨著 -甘露聚糖酶的添加量的提高，水解產物中甘露低聚糖的濃度也提高。在酶用量達 50%后，隨著 -甘露聚糖酶的添加量的提高，甘露低聚糖的濃度提高的趨勢不大。因此，選加酶量為 50%為最佳范圍。2.3.2水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響取自制酵母細胞壁 0.8 g，在 -甘露聚糖酶最適用量的條件下，60 下分別水解 2、3、4、5 h 和 6 h，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 3。從圖3 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細胞壁的過程中，隨著 -甘露聚糖酶水解時間的增加，甘露低聚糖的含量也隨之增加，當水解4 h 后含量繼續延長時間，但增加趨勢變小。因此，選擇4 h 為最佳水解范圍。2.3.3水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響-甘露聚糖酶最適用量的條件下，分別在45、50、55、60 和 65 水解 4 h。迅速取出放0.80.60.40.200 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5甘露低聚糖濃度/(mg/mL)吸光度（A）y=1.9269x-0.0374R2=0.9941圖 1 甘露糖標準曲線4.204.003.803.6030 40 50 60 70 80加酶量/(v/v，%)甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 2 加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響4.204.003.802 3 4 5 6水解時間/h甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 3 水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響生物工程8FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期4.94.64.343.7加酶量 底物濃度 水解時間 溫度 pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 7 因素指標關系圖在沸水浴中滅酶活，離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 4。蛋白酶在適宜的溫度下其活力最高，從圖 4可以看出，在 55 時，甘露低聚糖的濃度最高，隨著溫度升高，由于酶失去活性，水解效果減弱。因此，選擇 55 范圍較適宜。2.3.4 底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響5%、6%、7%、8%和 9%濃度的自制酵母細胞壁在 -甘露聚糖酶最適用量的條件下，55 進行水解反應 4 h 后，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 5。從圖 5 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細胞壁的過程中，隨著自制酵母細胞壁濃度的增加，甘露低聚糖的含量也隨之增加，自制酵母細胞壁濃度為 7%時，甘露聚糖酶對自制酵母細胞壁的降解程度達到最大。繼續增大酵母細胞壁的濃度，甘露低聚糖的含量卻減少，說明底物濃度過大會抑制 -甘露聚糖酶的活性。所以后續實驗選取最佳的自制酵母細胞壁加入量為 7%。2.3.5 pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響 在-甘露聚糖酶最適用量的條件下，控制一定的 pH值范圍進行水解反應，pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖6。改變 pH 值的大小，即改變溶液中氫離子濃度會影響蛋白酶作用的環境，進而影響酶活性。從圖 6 中可以看出，隨著 pH 的變化，甘露低聚糖的濃度呈現先增加后減少的趨勢，當pH值為 6.0時，甘露低聚糖的濃度最高。因此，選擇 pH 值6.0 為最適作用范圍。2.4 -甘露聚糖酶水解條件的優化考慮到各因素的相互作用和相互制約導致對水解效果的影響，進行正交實驗以確定各參數的最佳組合。按正交表 L16(45)設計實驗，以水解液中甘露低聚糖的濃度為測定指標。擬定出實驗方案(見表 1)來考察 5 個因素對 -甘露聚糖酶水解自制酵母細胞壁效果的影響。根據以上單因素水解條件，確定最佳水解條件的因素與水平，見表 1。采用 L16(45)表設計實驗，實驗結果見表 2。根據表 2 各因素的 k、R 的大小，對實驗結果進行分析。從圖 7 可以判斷出，各因素對指標影響的主次順序為底物濃度加酶量降解時間pH 值降解溫度，最優組合是 A3B3C4D3E2。由此得出最佳條件為：加酶量為 55%，底物濃度為8%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH值為6.0。由于最優組合并未出現在實驗中，所以需要對實驗進行驗證。驗證實驗結果見表 3。由驗證實驗可知，最優組合水解所得甘露低聚糖的濃度與正交實驗中出現的最高值接近，所4.704.404.1045 50 55 60 65水解溫度/甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 4 水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響3.803.603.403.203.005 6 7 8 9 10底物濃度/%甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 5 底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響4.604.203.803.403.005 6 7 8 9 10pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 6 pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響表 1 因素與水平表1 45 6 3 45 52 50 7 3.5 50 63 55 8 4 55 74 60 9 4.5 60 8水平因素加酶量(v/v，%) A底物濃度(w/v，%) B降解時間/hC溫度/DpH 值E生物工程9FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期表 2 正交實驗結果實驗號因素甘露低聚糖的含量/(mg/mL)A B C D E1 1 1 1 1 1 3.502 1 2 2 2 2 4.243 1 3 3 3 3 4.754 1 4 4 4 4 4.165 2 1 2 3 4 3.816 2 2 1 4 3 4.027 2 3 4 1 2 4.838 2 4 3 2 1 4.179 3 1 3 4 2 4.1610 3 2 4 3 1 4.5711 3 3 1 2 4 4.8012 3 4 2 1 3 4.4313 4 1 4 2 3 3.9914 4 2 3 1 4 4.3315 4 3 2 4 1 4.6216 4 4 1 3 2 4.35k14.163 3.865 4.168 4.273 4.215k24.208 4.290 4.275 4.300 4.395k34.488 4.750 4.353 4.375 4.298k44.322 4.278 4.388 4.240 4.275R 0.325 0.885 0.220 0.135 0.180以選擇 A3B3C4D3E2為最終組合。3 結論研究 -甘露聚糖酶水解條件的優化以水解產物中甘露低聚糖的濃度為指標，研究單因素下加酶量、底物濃度、水解時間、溫度和 pH 對自制酵母細胞壁的水解效果，進而通過正交實驗得到最佳水解條件為：底物濃度為 8%，加酶量為 55%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH 值為6.0。目前報道的-甘露聚糖酶都是水解含有 -1,4-D-甘露糖苷鍵的魔芋粉、角豆角、瓜兒豆等植物原料，對于水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母細胞壁的研究還未見報道，本實驗室保藏的菌種發酵獲得的-甘露聚糖酶可以水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母細胞壁。本實驗對影響-甘露聚糖酶水解效果的 5 個因素進行研究并確定了最佳的水解條件，可以為甘露低聚糖的來源、啤酒發酵殘渣的有效利用和減少啤酒工業帶來的環境污染提供新的思路。參考文獻：1 Schombug D, M Salzmann. Eyzyme handbook. SpringerVerlag Berlin Heideberg,1991,(4):1-52 Akino T, Nakamura Nand Horikoshi K. Production of -mannosidase and -mannanase by an alkalopHilic Bacillussp. Appl Microbio Biotechnol,1987,26(4):323-3273 Kempf M, Theobald U, Fiedler HP. Influence of dissolvedO2on the fermentative production of gallidermin byStapHylococcus gallinarum. Biotechnol Lett,1997,19:1063-10674 Clarke J H, Davidson K, Rixon J E, et al. Hazlewood GPA comparison of enzyme-aided bleaching of softwood paper pulp using combinations of xylanase,mannanase andagalactosidase. Appl Microbiol Biotechnol,2000,53:661 -6675 Kansoh A L, Nagieb Z A. Xylanase and mannanase enzymes from St