高效液相色譜 海南大學食品學院食品科學與工程（4）摘 要： 高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜關鍵詞： 簡介 發展歷史 特點 原理 應用1、 HPLC的簡介和使用方法1.1、簡介高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由于液體流動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。 1.2、HPLC的使用方法 使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用于化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。2、HPLC的發展歷史1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。 1971年科克蘭等人出版了液相色譜的現代實踐一書，標志著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。 1960年代前，使用的填充粒大于100m，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現了高速傳質，為高效液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵，但后者的脈沖信號很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7m，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。 2、 HPLC的特點和優點：高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。主要有以下幾個特點和優點。2.1、HPLC的特點：（1）高壓壓力可達150300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。（2）高速流速為0.110.0 mL/min。（3）高效塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。（4）高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。2.2、HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：（1）速度快通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。（2）分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。（3）靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。（4）色譜柱可反復使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。（5）樣品量少，容易回收樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。 高效液相色譜是在氣相色譜和經典色譜的基礎上發展起來的。現代液相色譜和經典液相色譜沒有本質的區別。不同點僅僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率 和實現了自動化操作。經典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現代液相色譜法。3、HPLC的原理及分類 3.1、HPLC的原理和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統也由兩相固定相和流動相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。色譜分離的實質是樣品分子（以下稱溶質）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。3.2、HPLC的分類根據分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。 4、色譜分離方法的選擇 要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據 是樣品的相對分子質量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩定程度以及化學結構等物理、化學性質。4.1、相對分子質量 對于相對分子質量較低（一般在200以下），揮發性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。相對分子質量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質量高于2000，則可用空間排阻色譜法。4.2、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。4.3、化學結構若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用于離子化合物；異構體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。5、HPLC的應用高效液相色譜的應用遠遠廣于氣相色譜法。它廣泛用于合成化學、石油化學、生命科學、臨床化學、藥物研究、環境監測、食品檢驗及法學檢驗等領域。 5.1、在食品分析中的應用 （1）食品營養成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機胺、礦物質等； （2）食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等； （3）食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環芳烴等。 5.2、在環境分析中的應用多環芳烴（特別是稠環芳烴）、農藥（如氨基甲酸脂類，反相色譜）殘留等。 5.3、 在生命科學中的應用 HPLC技術目前已成為生物化學家和醫學家在分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的工具。其在生化領域的應用主要集中于兩個方面： （1）低分子量物質，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。 （2）高分子量物質，如多肽、核糖核酸、蛋白質和酶（各種胰島素、激素、細胞色素、干擾素等）的純化、分離和測定。 過去對這些生物大分子的分離主要依賴于等速電泳、經典離子交換色譜等技術，但都有一定的局限性，遠遠不能滿足生物化學研究的需要。因為在生化領域中經常要求從復雜的混合物基質，如培養基、發酵液、體液、組織中對感性趣的物質進行有效而又特異的分離，通常要求檢測限達ng級或pg級，或pmol，fmol，并要求重復性好、快速、自動檢測；制備分離、回收率高且不失活。在這些方面，HPLC具有明顯的優勢。 5.4、 在醫學檢驗中的應用