第九章 紫外-可見分光光度法【學習目標】 1.掌握紫外-可見光譜的基本概念、有機化合物中電子躍遷的基本類型、紫外-可見光譜的定性分析方法和定量分析方法；2.熟悉紫外-可見光譜儀的基本原理；3.了解無機化合物的紫外-可見吸收光譜。4.能使用紫外-可見光譜法進行物質的定性和定量分析。 紫外可見分光光度法（ultravioletvisible spectrophotometry）是根據物質分子對波長為200800nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結構分析方法。按所吸收光的波長區域不同，分為紫外分光光度法(60-400nm)和可見分光光度法(400-800nm)合稱為紫外一可見分光光度法。這種分子吸收光譜源于價電子或分子軌道上電子的電子能級間躍遷，廣泛用于無機和有機物質的定量測定，輔助定性分析（如配合IR）。 第一節 紫外可見吸收光譜一、分子吸收光譜的產生分子由于受到紫外-可見光電磁輻射，分子間電子躍遷產生。通常，分子是處在基態振動能級上。當用紫外、可見光照射分子時，電子可以從基態激發到激發態的任一振動（或不同的轉動）能級上。因此，電子能及躍遷產生的吸收光譜，包括了大量譜線，并由于這些譜線的重疊而成為連續的吸收帶，這就是為什么分子的紫外、可見光普不是線狀光譜，而是帶狀光譜的原因。在分子中，除了電子相對于原子核的運動外，還有核間相對位移引起的振動和轉動。這三種運動能量都是量子化的，并對應有一定能級。下圖為分子的能級示意圖。圖9-1 分子中電子能級、振動能級和轉動能級示意圖 分子總能量：E分子 = E電子 + E振動 + E轉動當用頻率為的電磁波照射分子，而該分子的較高能級與較低能級之差E恰好等于該電磁波的能量 時，即能量變化的大小和入射光頻率的關系為： E = （ 普朗克常數h=6.62410-34Js=4.13610-15eVs，頻率，s-1,）此時，在微觀上出現分子由較低能級躍遷到較高的能級；在宏觀上則透射光的強度變小。用一連續輻射的電磁波照射分子，將照射前后光強度的變化轉變為電信號，并記錄下來，然后以波長為橫坐標，以電信號（吸光度 A）為縱坐標，就可以得到一張光強度變化對波長的關系曲線圖-紫外可見吸收光譜圖。 二、分子吸收光譜類型根據吸收電磁波的范圍不同，可將分子吸收光譜分為遠紅外光譜、紅外光譜及紫外、可見光譜三類。 分子的轉動能級差一般在0.0050.05eV。產生此能級的躍遷，需吸收波長約為250 25的遠紅外光，因此，形成的光譜稱為轉動光譜或遠紅外光譜。 分子的振動能級差一般在0.05 1 eV，需吸收波長約為25 1.25mm的紅外光才能產生躍遷。在分子振動時同時有分子的轉動運動。這樣，分子振動產生的吸收光譜中，包括轉動光譜，故常稱為振-轉光譜。由于它吸收的能量處于紅外光區，故又稱紅外光譜。電子的躍遷能差約為1 20 eV，比分子振動能級差要大幾十倍，所吸收光的波長約為12.5 0.06mm，主要在真空紫外到可見光區，對應形成的光譜，稱為電子光譜或紫外、可見吸收光譜。 通常，分子是處在基態振動能級上。當用紫外、可見光照射分子時，電子可以從基態激發到激發態的任一振動（或不同的轉動）能級上。因此，電子能級躍遷產生的吸收光譜，包括了大量譜線，并由于這些譜線的重疊而成為連續的吸收帶，這就是為什么分子的紫外、可見光譜不是線狀光譜，而是帶狀光譜的原因。又因為絕大多數的分子光譜分析，都是用液體樣品，加之儀器的分辨率有限，因而使記錄所得電子光譜的譜帶變寬。由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外區（60 200 nm）均有吸收，因此在測定這一范圍的光譜時，必須將光學系統抽成真空，然后充以一些惰性氣體，如氦、氖、氬等。鑒于真空紫外吸收光譜的研究需要昂貴的真空紫外分光光度計，故在實際應用中受到一定的限制。我們通常所說的紫外可見分光光度法，實際上是指近紫外、可見分光光度法。3、 紫外-可見吸收光譜的特征及其表示方法紫外可見吸收光譜是由分子中的電子能級躍遷而產生的，位于可見紫外區，可用紫外可見光光度計進行測定。將不同波長的的光一次通過一定濃度的被測物，并分別測定不同波長的吸光度，以波長作為橫坐標，一吸光度作為縱坐標所得的吸光度波長曲線，及吸收光譜（見圖9-2）。 圖9-2 不同濃度的KMnO4紫外吸收曲線 吸收光譜示意圖1-吸收峰；2-谷；3-肩峰；4-末端吸收 吸收光譜又稱吸收曲線，從9-2圖可以看出它的特征：曲線1處稱最大吸收峰，它所對應的波長稱最大吸收波長（max)。在曲線2處有一個谷稱最小吸收，它所對應的波長，稱最小吸收波長（min)。在1峰旁3處有一小峰，稱肩峰。在吸收曲線最短的一端，吸收較強但未形成峰形成峰部分，稱為末端吸收。吸收曲線的橫坐標，一般用波長（或頻率）表示。一定的波長對應一定的能量。不同物質的分子由于結構不同，發生越前時吸收光的能量也不相同，即吸收峰的位置也不同。所以吸收曲線在橫坐標的位置可作為分子結構的表征，是定型的主要依據。max是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，對鑒定化合物尤為重要；整個吸收光譜的形狀決定于物質性質，反應分子內部能級分布情況是物質定性的依據。 四、紫外-可見分光光度法的特點1. 靈敏度高。由于相應學科的發展，使新的有機顯色劑的合成和研究取得可喜的進展，從而對元素測定的靈敏度大大提高了一步。特別是由于多元絡合物和各種表面活性劑的應用研究，使許多元素的摩爾吸光系數由原來的幾萬提高到幾十萬。相對于其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和準確度一致公認是比較高的。不但在實際工作中光度法被廣泛采用，在標準參考物質的研制中，它更受重視，很多光度分析法已制定成為標準方法。2. 選擇性好。目前已有些元素只要利用控制適當的顯色條件就可直接進行光度法測定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測定，已有比較滿意的方法了。另外，在多組分共存的溶液中，可以畢竟分離而測定某種預定測組分。3. 通用性強，應用廣泛。不僅可用于無機化合物的分析測定，更重要的是由于許多有機化合物在紫外光區具有特征的吸收光譜，因而用來進行有機化合物的鑒定及其結構分析。分析由于各種各樣的無機物和有機物在紫外可見區都有吸收，因此均可借此法加以測定。到目前為止，幾乎化學元素周期表上的所有元素（除少數放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。4. 設備和操作簡單，價格低廉，分析速度快。廣泛地應用于化工、冶金、地質、醫學、食品、制藥等部門及環境監測系統。單在水質分析中的應用就很廣，目前能用直接法和間接法測定的金屬和非金屬元素就有七十多種。所涉及的水樣包括雨水、泉水、井水、飲用水、江水、湖水、河水、海水以及各種廢水等。光度法比較成熟，可測元素多，靈活性強。有些大型儀器不易解決的分析問題，光度法可以發揮作用。在有機分析中，紫外-可見光譜(UV-VIS)可作定量測定外，在定性分析和結構分析方面，它可作為紅外光譜(IR)、核磁共振(NMR)、質譜(MS)等方法的輔助手段。5. 準確度較好。對于一般的分光光度法來說，其濃度測量的相對誤差在1-3%范圍內，如采用示差分光度法測量，則誤差往往可減少到千分之幾。但僅適應于微量成分的測定二不適應于中、高含量的測定。6. 紫外-可見分光光度分析法的局限性。很多有機化合物在紫外光區沒有吸收或吸收不強烈。也有些有機化合物在紫外光區的吸收過于簡單，缺少驚喜結構，因而不足用來作為鑒定的依據。但作為物質結構分析的一種手段，紫外-可見分光光度分析法應具有一定的實用意義。在國際上發表的有關分析的論文總數中，光度法約占28%，我國約占所發表論文總數的33%。由于各種各樣的無機物和有機物在紫外-可見區域都有吸收，因此均可借此方法加以測定。到目前為止，幾乎周期表上的所有元素（除少數放射性元素和惰性氣體外）均可采用本法測定。在國際上，將1985-1989年分析儀器的世界銷售額按31大類進行分類統計，其中UV VIS分光光度計一直占有5-6%的份額，排名第五。由于光度計的價格相對比較低廉，故若以儀器銷售的臺數技術的話，則分光光度計將排在第二位。儀器的銷售情況可以從側面反映各類分析儀器在實際使用中的廣泛和頻繁程度。 紫外-可見分光光度法在藥物分析中的應用歷來受到大家的廣泛關注和重視,世界各國都進行這一領域的相關研究。據統計,在藥物分析中，分光光度法占29.1%，色譜法占25.5%，熒光、化學發光法占2.4%，與光度法有關的方法共計占31.5%，由此可見，紫外-可見分光光度法是藥物分析最常用的方法之一。研究結果表明，紫外-可見光度法在藥物分析中的可靠性可以和色譜法相蓖美，但其設備簡單、操作方便、價格低廉、易于普及等特點是色譜法難于做到的。因此，可以相信，光度法在藥物分析中將大有作為。 紫外可見分光光度法在醫藥方面的應用第二節 化合物紫外可見光譜的產生在紫外和可見光譜區范圍內，有機化合物的吸收帶主要由ss*、pp*、ns*、np*及電荷遷移躍遷產生。無機化合物的吸收帶主要由電荷遷移和配位場躍遷（即dd躍遷和ff躍遷）產生。 由于電子躍遷的類型不同，實現躍遷需要的能量不同，因此吸收光的波長范圍也不相同。其中ss*躍遷所需能量最大，np*及配位場躍遷所需能量最小，因此，它們的吸收帶分別落在遠紫外和可見光區。從圖中可知，pp*（電荷遷移）躍遷產生的譜帶強度最大，ss*、np*、ns*躍遷產生的譜帶強度次之，（配位躍遷的譜帶強度最小）。一、有機化合物的紫外可見吸收光譜（一）、躍遷類型 基態有機化合物的價電子包括成鍵電子、成鍵電子和非鍵電子（以 n表示）。分子的空軌道包括反鍵s*軌道和反鍵p*軌道，因此，可能的躍遷為ss*、pp*、ns* np*等。 1. ss*躍遷 它需要的能量較高，一般發生在真空紫外光區。飽和烴中的CC鍵屬于這類躍遷，例如乙烷的最大吸收波長max為135nm。 2. ns*躍遷 實現這類躍遷所需要的能量較高，其吸收光譜落于遠紫外光區和近紫外光區，如CH3OH和CH3NH2的ns*躍遷光譜分別為183nm和213nm。 3. pp*躍遷 它需要的能量低于*躍遷，吸收峰一般處于近紫外光區，在200 nm左右，其特征是摩爾吸光系數大，一般max104，為強吸收帶。如乙烯（蒸氣）的最大吸收波長max為162 nm。 4. np*躍遷 這類躍遷發生在近紫外光區。它是簡單的生色團如羰基、硝基等中的孤對電子向反鍵軌道躍遷。其特點是譜帶強度弱，摩爾吸光系數小，通常小于100，屬于禁阻躍遷。 5. 電荷遷移躍遷 所謂電荷遷移躍遷是指用電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向與接受體相聯系的軌道上躍遷。因此，電荷遷移躍遷實質是一個內氧化還原的過程，而相應的吸收光譜稱為電荷遷移吸收光譜。例如某些取代芳烴可產生這種分子內電荷遷移躍遷吸收帶。電荷遷移吸收帶的譜帶較寬，吸收強度較大，最大波長處的摩爾吸光系數max可大于104。 （二）、常用術語 1. 生色團 從廣義來說，所謂生色團，是指分子中可以吸收光子而產生電子躍遷的原子基團。但是，人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團或結構系統定義為生色團。 2. 助色團 助色團是指帶有非鍵電子對的基團，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當它們與生色團相連時，會使生色團的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸光度。 3. 紅移與藍移（紫移）某些有機化合物經取代反應引入含有未共享電子對的基團（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）之后，吸收峰的波長將向長波方向移動，這種效應稱為紅移效應 這種會使某化合物的最大吸收波長向長波方向移動的基團稱為向紅基團。 在某些生色團如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波長會向短波方向移動，這種效應稱為藍移（紫移）效應。這些會使某化合物的最大吸收波長向短波方向移動的基團（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）稱為向藍（紫）基團。 (三) 有機化合物紫外-可見吸收光譜 1. 飽和烴及其取代衍生物 飽和烴類分子中只含有s鍵，因此只能產生ss*躍遷，即s電子從成鍵軌道（ s）躍遷到反鍵軌道（ s*）。飽和烴的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可見分光光度計的測量范圍。 飽和烴的取代衍生物如鹵代烴，其鹵素原子上存在n電子，可產生ns*的躍遷。ns*的能量低于ss*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的ns*躍遷分別出現在173、204和258nm處。這些數據不僅說明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應的吸收波長發生了紅移，顯示了助色團的助色作用。直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實用價值不大。但是它們是測定紫外和（或）可見吸收光譜的良好溶劑。 2. 不飽和烴及共軛烯烴 在不飽和烴類分子中，除含有s鍵外，還含有p鍵，它們可以產生ss*和pp*兩種躍遷。 ss*躍遷的能量小于pp*躍遷。例如，在乙烯分子中， pp*躍遷最大吸收波長為180nm。在不飽和烴類分子中，當有兩個以上的雙鍵共軛時，隨著共軛系統的延長， pp*躍遷的吸收帶 將明顯向長波方向移動，吸收強度也隨之增強。在共軛體系中，pp*躍遷產生的吸收帶又稱為K帶。 3. 羰基化合物 羰基化合物含有C=O基團。 C=O基團主要可產生pp*、ns*、np*三個吸收帶，np*吸收帶又稱R帶，落于近紫外或紫外光區。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮這類物質與羧酸及羧酸的衍生物在結構上的差異，因此它們np*吸收帶的光區稍有不同。 羧酸及羧酸的衍生物雖然也有np*吸收帶，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接連結含有未共用電子對的助色團，如-OH、-Cl、-OR等，由于這些助色團上的n電子與羰基雙鍵的電子產生np*共軛，導致p*軌道的能級有所提高，但這種共軛作用并不能改變n軌道的能級，因此實現np*躍遷所需的能量變大，使np*吸收帶藍移至210nm左右。 4. 苯及其衍生物 苯有三個吸收帶，它們都是由pp*躍遷引起的。E1帶出現在185nm（max= 68000）； E2帶出現在204nm（ max = 8800 ）；B帶出現在230270nm （max= 200）。在氣態或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜帶有許多的精細結構，這是由于振動躍遷在基態電子上的躍遷上的疊加而引起的。在極性溶劑中，這些精細結構消失。當苯環上有取代基時，苯的三個特征譜帶都會發生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B譜帶。 5. 稠環芳烴及雜環化合物 稠環芳烴，如奈、蒽、芘等，均顯示苯的三個吸收帶，但是與苯本身相比較，這三個吸收帶均發生紅移，且強度增加。隨著苯環數目的增多，吸收波長紅移越多，吸收強度也相應增加。當芳環上的-CH基團被氮原子取代后，則相應的氮雜環化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與奈相似。此外，由于引入含有n電子的N原子的，這類雜環化合物還可能產生np*吸收帶。常見有機化合物的生色團的紫外吸收峰，見下表： 常見有機化合物的生色團的紫外吸收峰化合物生色團lmax/ nm化合物生色團lmax/ nm烷烴-C-C-150共軛烯烴 (-C=C-)2210-230烯烴C=C170(-C=C-)3260炔烴-CC-170(-C=C-)5330酰R-C205苯 204醛R-C210255羧酸R-C200-210萘 220硝基化合物-NO270-280275亞硝基化合物-NO220-230314偶氮化合物 -N=N-285-400 二、無機化合物的紫外-可見吸收光譜 產生無機化合物紫外、可見吸收光譜的電子躍遷形式，一般分為兩大類：電荷遷移躍遷和配位場躍遷。 （一）電荷遷移躍遷無機配合物有電荷遷移躍遷產生的電荷遷移吸收光譜。在配合物的中心離子和配位體中，當一個電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關的軌道上時，可產生電荷遷移吸收光譜。不少過度金屬離子與含生色團的試劑反應所生成的配合物以及許多水合無機離子，均可產生電荷遷移躍遷。此外，一些具有d10電子結構的過度元素形成的鹵化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于這類躍遷而產生顏色。電荷遷移吸收光譜出現的波長位置，取決于電子給予體和電子接受體相應電子軌道的能量差。 （二）配位場躍遷 配位場躍遷包括d - d 躍遷和f - f 躍遷。元素周期表中第四、五周期的過度金屬元素分別含有3d和4d軌道，鑭系和錒系元素分別含有4f和5f軌道。在配體的存在下，過度元素五個能量相等的d軌道和鑭系元素七個能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道和f軌道。當它們的離子吸收光能后，低能態的d電子或f電子可以分別躍遷至高能態的d或f軌道，這兩類躍遷分別稱為d - d 躍遷和f - f 躍遷。由于這兩類躍遷必須在配體的配位場作用下才可能發生，因此又稱為配位場躍遷。三、影響紫外可見吸收光譜的影響譜帶位移包括藍移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)和紅移(bathochromic shift or red shift)。藍移（或紫移）指吸收峰向短波長移動，紅移指吸收峰向長波長移動。吸收峰強度變化包括增色效應(hyperchromic effect)和減色效應(hypochromic effect)。前者指吸收強度增加，后者指吸收強度減小。 試樣的化學環境對譜帶的波長位移及強度變化有著重要的影響，其中對譜帶位移產生較大影響的主要有酸度和溶劑效應。 1.酸度的影響：由于酸度的變化會使有機化合物的存在形式發生變化，從而導致譜帶的位移，例如苯酚 隨著pH值的增高，譜帶就會紅移，吸收峰分別從211 nm和270 nm位移到236 nm和287nm。又如苯胺 隨著pH值的降低，譜帶會藍移，吸收峰分別從230 nm和280 nm處位移到203 nm和254 nm處。另外酸度的變化還會影響到絡合平衡，從而造成有色絡合物的組成發生變化，而使得吸收帶發生位移，例如Fe (III) 與磺基水楊酸的絡合物，在不同pH時會形成不同的絡合比，從而產生紫紅、橙紅、黃色等不同顏色的絡合物。2. 溶劑對紫外可見吸收光譜的影響 溶劑對紫外可見光譜的影響較為復雜。改變溶劑的極性，會引起吸收帶形狀的變化。例如，當溶劑的極性由非極性改變到極性時，精細結構消失，吸收帶變向平滑。改變溶劑的極性，還會使吸收帶的最大吸收波長發生變化。下表為溶劑對亞異丙酮紫外吸收光譜的影響。 名稱正己烷CHCl3 CH3OHH2Opp* max/nm 230238237243n p*max/nm329315309305 由上表可以看出，當溶劑的極性增大時，由n p*躍遷產生的吸收帶發生藍移，而由pp* 躍遷產生的吸收帶發生紅移。因此，在測定紫外、可見吸收光譜時，應注明在何種溶劑中測定。 由于溶劑對電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數據表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對照時也應注明所用的溶劑是否相同。在進行紫外光譜法分析時，必須正確選擇溶劑。選擇溶劑時注意下列幾點： （1）溶劑應能很好地溶解被測試樣，溶劑對溶質應該是惰性的。即所成溶液應具有良好的化學和光化學穩定性。 （2）在溶解度允許的范圍內，盡量選擇極性較小的溶劑。（3） 溶劑在樣品的吸收光譜區應無明顯吸收。 第三節 光的吸收定律朗伯-比耳定律 一、透射比和吸光度 當一束平行光通過均勻的溶液介質時，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia，透射光強度為It，反射光強度為Ir，則 在進行吸收光譜分析中，被測溶液和參比溶液是分別放在同樣材料及厚度的兩個吸收池中，讓強度同為I0的單色光分別通過兩個吸收池，用參比池調節儀器的零吸收點，再測量被測量溶液的透射光強度，所以反射光的影響可以從參比溶液中消除，則上式可簡寫為 透射光強度(It)與入射光強度(I0)之比稱為透射比(亦稱透射率)，用T表示，則有: 溶液的T越大，表明它對光的吸收越弱；反之，T越小，表明它對光的吸收越強。為了更明確地表明溶液的吸光強弱與表達物理量的相應關系，常用吸光度(A)表示物質對光的吸收程度，其定義為: 則A值越大，表明物質對光吸收越強。T及A都是表示物質對光吸收程度的一種量度，透射比常以百分率表示，稱為百分透射比，T；吸光度A為一個無因次的量，兩者可通過上式互相換算。 二、朗伯-比耳定律 朗伯比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據和基礎。當入射光波長一定時，溶液的吸光度A是吸光物質的濃度c及吸收介質厚度l(吸收光程)的函數。朗伯和比耳分別于1760年和1852年研究了這三者的定量關系。朗伯的結論是，當用適當波長的單色光照射一固定濃度的均勻溶液時，A與l成正比，其數學式為: A = kl (此即稱為朗伯定律，k為比例系數 ) 而比耳的結論是，當用適當波長的單色光照射一固定液層厚度的均勻溶液時，A與c成正比，其數學表達式為: (此即稱為比耳定律，k稱為比例系數) 合并上述k的數值取決于吸光物質的特性外，其單位及數值還與c和l所采用的單位有關。l通常采用cm為單位，并用b表示。所以k的單位取決c采用的單位。 當c采用重量單位g/L時，吸收定律表達為: (a稱為吸光系數，單位為) 當c采用摩爾濃度mol/L時，吸收定律表達為: (稱摩爾吸光系數，單位為) 當一束平行光通過均勻的溶液介質時，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。設入射光強度為I0，透射光強度為It，溶液的濃度為c，液層的寬度為b，根據朗伯比爾定律可知他們之間有下列關系，則圖9-3 輻射吸收示意圖A稱為吸光度（absorbance），吸收度或光密度（OD，optical density），a稱為吸收系數(absorotiviry)，是化合物分子的特性，它與濃度（c）和光透過介質的厚度（b）無關。當c為摩爾濃度，b以厘米為單位，a即以來表示，稱為摩爾吸光系數或摩爾消光系數（molar absorptivity）。 如何將朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律用于紫外-可見分光光度法？課堂討論按朗伯-比耳Lambert-Beer定律可進行定量測定。測量時盛溶液的吸收池厚度為b，若濃度c已知，測得吸光度A即可計算出值，即為化合物的物理常數。若已知值，則由測得的吸光度可計算溶液的濃度。由上述可見，當測定一個化合物的吸收光譜時，被吸收光的波長和摩爾吸光系數的兩個重要的參數，前者表示吸收能量的大小，后者反映能級躍遷的幾率，屬于化合物的特性。3、 偏離光吸收定律的因素定量分析時通常也曾厚度是相同的，按照朗伯比爾定律，濃度與吸光度之間的關系應該是一條通過直角坐標原點的直線。但在實際工作中，往往會偏離線性二發生彎曲。若在彎曲部分進行定量，將產生較大的測定誤差。1. 物理因素 朗伯比爾定律只對一定波長的單色光才能成立，但在實際工作中，即使質量較好的分光光度計所得的入射光，榮然具有一定波長范圍的波帶寬度。在這種情況下，吸光度與濃度并不完全呈線性關系，因而導致朗伯比爾定律的偏離。所得入射光的波長范圍越窄，即“單色光”越純，則偏離越小入射光不存或雜散光等的影響；非吸收作用引起的對朗伯比爾定律的偏離，主要有散射效應和熒光效應，一般情況下熒光效應對分光光度法產生影響較小。朗伯比爾定律只只適應于十分均勻的吸收體系。當待測液的體系不是很均勻時，入射光通過待測液后將產生光的散射而損失，導致吸收體系的透過率減小，造成實測吸光值增加。朗伯比爾定律是建立在均勻、非散射的溶液的基礎上的。如果戒指不均勻，呈交替、乳濁、懸浮狀態，則入射光除了被吸收外，還會有反射、散射的損失，因而實際測得的吸光度增大，導致對朗伯比爾定律的偏離；當入射光透過待測液，若吸光物質分子吸收輻射能后所產生的激發態分子以發射輻射能的方式回到基態而發射熒光，結果必然使待測液的透光率相對增大，造成實測吸光值減小。2. 化學因素溶質的理解、算效應、溶劑作用等會引起朗伯比爾定律的偏離。其中有色化合物的離解是偏離朗伯比爾定律的主要化學因素。溶液稀釋時，上述平衡向右，理解度增大。（1） 離解作用。在可見光區域的分析中常常是將待測組分同某種試劑反應成有色配合物來進行測定的。有色配合物在水中不可避免的要發生離解，從而使得有色配合物的濃度要小于待測組分的濃度，導致對吸收定律的偏離。特別是對于稀溶液而言，更是如此。（2） 酸效應。如果待測組分包括在一種酸堿平衡體系中，溶液的酸度將會使得待測組分的存在形式發生變化，二導致對吸光定律的偏離。（3） 溶劑作用。溶劑對吸收光譜的影響是比較大的，溶劑不同時，物質的自首光譜也不同。4、 吸光度的加和性如果溶液中含有幾種有幾種彼此之間不相互作用的組分，他們對某一波長的光都產生吸收，那么該溶液對該波長總吸收等于溶液中幾種組分的吸光度之和，就也就是說吸光度具有加和性，也可表示為： A總=A1+A2+A3+An=1c1b+2c2b+3c3b+ncnb =（1c1+2c2+3c3+ncn)b 吸光度的加和性對多組分同時定量測定，校正干擾等都有很大用處。 第4節 紫外-可見分光光度計 1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人將分光光度法應用于定量分析化學領域，并且設計了第一臺比色計。到1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外可見分光光度計。此后，紫外可見分光光度計經不斷改進，又出現自動記錄、自動打印、數字顯示、微機控制等各類型的儀器，使光度法的靈敏度和準確度也不斷提高，其應用范圍也不斷擴大。分光光度計自生產到目前為止，得到了很大的發展，類型也很多。國產分光光度計近十年來已有了很大的發展，各種檔次的分光光度計都已更新升級換代，可見光系列有：721、722、723等型號，紫外可見光系列有：751、752、753、UV-1800、UV-1801等型號，主要生產廠為上海分析儀器總廠等。 一、儀器部件介紹紫外-可見分光光度計的基本結構是由五個部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號指示系統。其工作原理如圖9-4所示。光源單色器吸收池檢測器信號顯示、記錄裝置 圖9-4 分光光度計工作原理圖 1. 光源 對光源的基本要求是應在儀器操作所需的光譜區域內能夠發射連續輻射，有足夠的輻射強度和良好的穩定性，而且輻射能量隨波長的變化應盡可能小。分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。 熱輻射光源用于可見光區，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340 2500nm。這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關，在可見光區，輻射的能量與工作電壓4次方成正比。光電流與燈絲電壓的n次方（n1）成正比。因此必須嚴格控制燈絲電壓，儀器必須配有穩壓裝置。在近紫外區測定時常用氫燈和氘燈。它們可在160 375 nm范圍內產生連續光源。氘燈的燈管內充有氫的同位素氘，它是紫外光區應用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強度比相同功率的氫燈要大35倍。2. 單色器單色器是能從光源輻射的復合光中分出單色光的光學裝置，其主要功能：產生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區域內任意可調。單色器一般由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度度、選擇性及校準曲線的線性關系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。 棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350 3200 nm的波長范圍，即只能用于可見光域內。石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185 4000nm，即可用于紫外、可見和近紅外三個光域。 光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個波長區具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領高、成本低、便于保存和易于制備等優點。缺點是各級光譜會重疊而產生干擾。入射、出射狹縫，透鏡及準光鏡等光學元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會減弱光強。3. 吸收池 吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區及紫外光區，玻璃吸收池只能用于可見光區。為減少光的損失，吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測定中（紫外區尤其重要），吸收池要挑選配對。因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結果都有影響。紫外光譜儀吸收池恰好安排在光電轉換前。4. 檢測器 檢測器的功能是檢測信號、測量單色光透過溶液后光強度變化的一種裝置。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。 硒光電池對光的敏感范圍為300800nm，其中又以500 600nm最為靈敏。這種光電池的特點是能產生可直接推動微安表或檢流計的光電流，但由于容易出現疲勞效應而只能用于低檔的分光光度計中。 光電管在紫外-可見分光光度計上應用較為廣泛。 光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對光譜的精細結構有較好的分辨能力。5. 信號指示系統 它的作用是放大信號并以適當方式指示或記錄下來。常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調節指零裝置以及數字顯示或自動記錄裝置等。很多型號的分光光度計裝配有微處理機，一方面可對分光光度計進行操作控制，另一方面可進行數據處理。二、儀器的分類分光光度計可分為三種類型，即單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。 1. 單光束分光光度計 經單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計結構簡單，操作方便，維修容易，適用于常規分析。國產722型、751 型、724型、英國SP500型以及Backman DU-8型等均屬于此類光度計。圖6 單光束分光光度計原理圖 2. 雙光束分光光度計 經單色器分光后經反射鏡分解為強度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經對數變換將它轉換成吸光度并作為波長的函數記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。這類儀器有國產710型、730型、740型等。圖6 單波長雙光束分光光度計原理圖 3. 雙波長分光光度計由同一光源發出的光被分成兩束，分別經過兩個單色器，得到兩束不同波長（1和2）的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經過光電倍增管和電子控制系統，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值AA=A(1)-A(2)。對于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導數光譜。 圖7 雙波長分光光度計光路示意圖 三、實驗室常用儀器1. 721型可見分光光度計721型可見分光光度計是在72基礎上改進而成的，他的結構比72型合理，性能比72型亦有顯著提高，工作波段為360800nm，用鎢絲白熾燈作光源，棱鏡做單色器，采用自準式光路，用CD-7型真空光電管作為光電轉換原件，以場效應管作放大器，可測微弱的光電流變化，用微安表作為讀書器。儀器有較高的靈敏度。2. 722型可見分光光度計與721型可見分光光度計相比，722型可見分光光度計不再用指針指示讀數，變為數字顯示的。對旋鈕進行了改造。也可直接讀出濃度c。3. 751型紫外-可見分光光度計751型紫外可見分光光度計是一種波長范圍較寬（2001000nm）、精確度較高的分光光度計。不僅用于可見光區，也能用于紫外及近紅外光區的分析。由光源（鎢絲燈或氫燈）發出的光線由反射鏡反射，是光線經狹縫的下半部和準光鏡進入單色器，經棱鏡色散后，由準光鏡將光聚焦與狹縫上半部而射出，經液槽照射于光電管上。由此可見，次一起用同一狹縫作為如光和出光狹縫，他們始終具有相同的寬度。棱鏡和透鏡均用石英材料制成，反光鏡和準光鏡表面鍍鋁。所以全部系統保證紫外光譜通過。波長范圍在200320nm范圍用氫燈作光源；波長在3201000nm范圍用鎢絲燈作光源。波長在200625nm用藍敏光電管接收透射光。波長在6251000nm用紅敏光電管接收透射光。吸光度和透光率刻在電位差計轉盤上，而電流計啟示零作用。4. 9200型紫外-可見分光光度計 性能優良，適應。數字顯示，觸摸顯示，觸摸式鍵，進行濃度c直讀，可與打印機連接。5. 9600型紫外-可見分光光度計性能優良，適應。數字顯示，觸摸顯示，觸摸式鍵，可做多條濃度曲線，從而選擇后進行濃度直讀，同時，也可與打印機連接。6. 1201型紫外-可見分光光度計用電腦來進行控制儀器，我們需要做的工作就是放樣品。可以進行光譜掃描、定量、定性分析。對數據的而處理可以通過軟件來進行。7. T6型紫外-可見分光光度計 雜散光低、穩定性出色、軟件靈活升級；人性化的整體設計，可針對各行各業定制的測量軟件包；，電腦操作，方法簡單。8. UV-1801型紫外-可見分光光度計 波長范圍寬，5nm、2nm、1nm、三種光譜帶寬可滿足藥典的嚴格要求；手動寬大四連池；測量方法豐富，具有波長掃描、時間掃描、多波長測定、多階導數測定（選）、雙波長（選）、三波長（選），DNA蛋白質測量（選）等多種測量方法，可滿足不同測量的要求；同時，電腦操作，方法簡單。9. UV-1800型紫外-可見分光光度計優良的光學性能、低雜散光、穩定性高、噪音低；樣品室可拆卸不、光源室開放式。同時，用電腦來進行控制儀器，我們需要做的工作就是放樣品。可以進行光譜掃描、定量、定性分析。對數據的而處理可以通過軟件來進行 以上儀器可供物理、化學、醫學、生物學等學科進行科研或供化學工業、食品工業。制藥工業、冶金工業網、環境保護部門進行各種無知己的定性、定量分析。 第5節 紫外-可見分光光度法分析條件的選擇 利用紫外可見分光光度法進行分析，條件的選擇會直接影響到實驗效果。所以選擇合適的實驗條件是一項十分重要的實驗技術。一、溶劑選擇原則 （1）不與被測組分發生化學反應。 （2）所選溶劑在測定波長范圍內無明顯吸收。 （3）溶劑應能很好地溶解被測試樣，溶劑對溶質應該是惰性的，即所成溶液應具有良好的化學和光學穩定性。 （4）在溶解允許的范圍內，盡量選擇極性較小的溶劑。（見第二節） （5）被測組分在所選的溶劑中有較好的峰形。二、測量條件的選擇選擇適當的測量條件，是獲得準確測定結果的重要途徑。選擇合適的測量條件，可以從下列幾個方面考慮。 1. 入射波長的選擇 通常是根據北側組分的吸收光譜，選擇最強吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當最強吸收峰的峰形比較尖銳時，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強峰進行測定；或者是有干擾時，則選用靈敏度較低但能避免干擾的入射光，就能獲得滿意的測定結果。2.狹縫寬度的選擇為了選擇合適的狹縫寬度，應以減少狹縫寬度時試樣的吸光度不再增加為準。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的1/10。3. 吸光度測定范圍的選擇在不同吸光度范圍內讀數會引起不同程度的誤差，為提高測定準確度，硬選擇最適宜的吸光度范圍進行測定。任何類型的分光光度計都有一定的誤差，但對于一臺分光光度計來說，透光率讀數誤差T是一常數（約為0.2%2%）。但透光率誤差并不能代表結果誤差，測定結果誤差常用c/c表示。 由朗伯比爾定律可知 A=-lgT=bc將上式微分整理可得 要使測定的相對誤差c/c最小，求導取極小得出：當T=0.368（A=0.434）時，c/c最小（為1.4%），假設T=0.5%，將其帶入上式，則可計算出不同透光率時濃度相對誤差c/c，如下表所示。不同透光率時濃度相對誤差見下表：T/%Ac/c/%T/%Ac/c/%950.02210.2400.3991.36900.0465.3300.5231.38800.0972.8200.6991.55700.1552.0101.0002.17600.2221.6331.5234.75500.3011.4421.6996.38 由上表可以看出濃度相對誤差的大小與透光率讀數范圍有關。當所測吸光度在0.151.00的范圍內時，濃度測量誤差為1.4%2.2%，測量的吸光度過低或過高，誤差都是非常的，因此普通分光光度計不適于高含量或極低含量物質的測定，一般最適宜的測量范圍為0.20.8之間。實際工作中，可以通過調節北側溶液的濃度，使其在適宜的吸光度范圍。為此，可以從以下兩個方面考慮：計算而且控制試樣的稱出量，含量高時，少取樣或稀釋試液；含量低時，可多取樣或萃取富集；如果溶液已顯色，則可通過改變吸收池的厚度來調節吸光度的大小。4. 參壁溶液的選擇測定試樣溶液的吸光度，需先用殘壁溶液調節透光率為100%（或吸光度值為0），以消除其他成分及吸光吃和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。殘壁溶液是用于調節儀器工作零點的，若選擇不適當，對測量讀數準確度和影響較大參比溶液的選擇視分析體系而定，選擇的方法是：（1）溶劑參比。試樣簡單、共存其他成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素。（2）試樣參比。如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反應相同的條件處理試樣，只是補加入顯色劑。（3） 試劑參比。如果繳入試劑或其他試劑在測定波長有吸收，按顯色反應相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。（4） 平行曹鎖參比。用不含北側組分的試樣，在相同條件下與被測試樣同時進行處理，由此得到平行操作參比溶液。此外，對吸收池厚度、透光率、儀器波長、讀數刻度等應進行校正。三、反應條件的選擇在分光光度分析中，將試樣中被測組分轉變成有色化合物的化學反應叫顯色反應。顯色反應可分為兩大類，配位反應和氧化還原反應，而配位反應是最主要的顯色反應。與被測組分化合車固有色物質的試劑稱為顯色劑。同一被測組分常可與若干種顯色劑反應，生成多種有色化合物，其原理和靈敏度亦有差別。一種北側組分究竟應該用哪種顯色反應，可根據所需標準加以選擇。（1） 顯色劑的選擇 1.選擇性好所用的顯色劑僅與被測組分顯色，而與其他共存組分不顯色，或者其他組分干擾容易被消除，或者顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠。2. 靈敏度要足夠高靈敏度高的顯色反應有利于微量組分的測定。靈敏度的高低，可由摩爾吸光系數值得大小來判定。摩爾吸光系數值越大，靈敏度越高。但應注意，靈敏度高的顯色反應，并不一定選擇性好；對于搞含量的組分，不一定要選用靈敏度高的顯色反應。3. 有色配合物的組成要恒定顯色劑與被測物質的反應要定量進行，生成有色配合物的組成要恒定。化學性質要穩定，有色化合物的組成若不符合一定的化學式，測定的再現性就差。4. 生成的有色配合物穩定性好生成的有色配合物穩定性要好，既要求配合物有較大的穩定常數，有色配合物不易受外界環境的影響，亦不受溶液中其他化學因素的影響。有較好的重現性，結果才準確。5. 色差大有色配合物與顯色劑之間的顏色差別要大，試樣試劑空白小，顯色時顏色變化才明顯。通常把兩種有色物質最大吸收波長之差稱為“比色度”。一般要求有色配合物與顯色劑之間的對比度在60nm以上。6. 顯色反應的條件要易于控制如果條件要求過于苛刻，難以控制，測定結果的再現性就差。顯色劑一般分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類。許多無機顯色劑能與金屬離子起顯色反應，如Cu