血清堿性磷酸酶活性測定 磷酸苯二鈉法 問題1 為何要測定血清中酶的活性 有什么意義 酶活性測定是目前臨床酶學分析最為常用的方法 酶測定約占目前臨床生化總工作量的1 4到1 2 用于診斷的酶類已超過100多種 常用的數十種 血漿酶 血漿特異酶 非血漿特異酶 外分泌酶 細胞內酶 一 血漿特異酶 在血漿中發揮特定催化作用的酶 如凝血酶 膽堿酯酶 CHE 脂蛋白脂肪酶 銅氧化酶等 它們大多數在肝內合成 在血漿中的濃度甚至超過器官細胞內濃度 有的可以作為肝功能試驗的一部分 血漿特異酶活性的改變 除了反映血液功能外 還反映來源器官的功能 二 非血漿特異酶 在血漿中濃度很低 且無功能 分為兩種 1 分泌酶 來源于消化腺或其他外分泌腺的酶 如 淀粉酶 AMY 前列腺酸性磷酸酶 ACP 脂肪酶 LPS 胃蛋白酶原 胰蛋白酶原 ALP等 正常體液中外分泌酶活性低而穩定 不發生催化作用 在血液中的濃度和其分泌腺體的功能活動和疾病有關 來源增加或排泄受阻時 血漿中此類酶活性增高 例如 急性胰腺炎時 血淀粉酶就會升高 2 代謝酶 細胞酶 在細胞內發揮催化功能的酶 正常時這些酶存在于組織細胞中 血漿中酶活性很低 細胞內 外濃度差異懸殊 當酶來源的組織細胞發生病變 細胞膜通透性增加或細胞壞死時 細胞內酶大量進入血漿 導致血漿酶活性顯著增高 其下降的臨床意義很少 這一類酶臨床應用較多 如轉氨酶 乳酸脫氫酶 肌酸激酶等 它們在肝病 心臟疾病時都可能出現變化 一些酶在不同器官 組織 細胞內的分布和定位存在明顯差異 而且在細胞內外有明顯濃度梯度差 正常情況下血漿中酶活性相對恒定 但一些病理情況常導致血漿中酶活性的改變 性別 年齡 運動 妊娠 人種及環境因素等可引起人血漿中某些酶的生理性變化 所以酶與其它指標相比具有更高的診斷特異性和靈敏度 診斷常用血清酶 血清酶符號來源 鳥氨酸氨基甲酰轉移酶OCT肝卵磷脂膽固醇?；D移酶LCAT肝谷氨酸脫氫酶GLDH肝山梨醇脫氫酶SDH肝丙氨酸氨基轉移酶ALT肝 腎 心異檸檬酸脫氫酶ICD肝 胎盤 心 谷氨酰轉肽酶 GT肝 膽 腎 小腸5 核苷酸酶5 NT肝 膽道單胺氧化酶MAO肝 腎 腦天門冬氨酸氨基轉移酶AST心 肝 骨骼肌肌酸激酶CK骨骼肌 心 腦乳酸脫氫酶LDH心 腎 骨骼肌 肝 肺堿性磷酸酶ALP骨骼 牙齒 肝 腎酸性磷酸酶ACP前列腺 紅細胞 血小板淀粉酶AMS胰 唾液腺脂肪酶LPS胰 堿性磷酸酶 Alkalinephosphatase ALPorAKP ALP幾乎存在于機體各個組織 但以骨骼 牙齒 肝臟和腎臟中含量較多 兒童期含量尤其多 ALP有六種同功酶 其中AKP1 AKP2 AKP6來自肝臟 AKP3來自骨細胞 AKP4產生于胎盤及癌細胞 而AKP5來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞 臨床上測定ALP活性主要用于肝臟疾病和骨骼疾病的診斷 當肝臟受到損傷或者障礙時經淋巴道和肝竇進入血液 同時由于肝內膽道膽汁排泄障礙 反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高 是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶 即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去 并生成磷酸根離子和自由的羥基 這類底物包括核酸 蛋白 生物堿等 而該脫去磷酸基團的過程稱為去磷酸化或脫磷酸化 堿性磷酸酶在堿性環境中有最大活力 什么是ALP 問題1 為什么要測定堿性磷酸酶的活性 有什么意義 1 生理性增加 如兒童 妊娠期 進食高糖 高脂肪食物等均可使血清ALP活性增高 2 病理性改變 升高 1 肝膽疾病 主要見于阻塞性黃疸 急 慢性黃疸性肝炎 肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高 其中以癌性梗阻最明顯 2 各種骨骼疾病 ALP主要由成骨細胞產生 故骨骼病特別是有新生骨質生成時 血液內ALP活性增加 以促進磷酸鹽的沉積 如佝僂病 纖維性骨病 成骨不全癥 骨轉移癌和骨折修復愈合期等均引起血清ALP活力升高 降低 主要見于呆小癥 磷酸酶過少癥等 問題2 如何測定酶活性 酶活性 酶催化某一化學反應的能力常用單位時間內底物的減少量或產物的生成量 即酶促反應速度 來表示酶活性大小 注 在實際測定酶促反應速度時 以測定單位時間內產物的生成量為好 固定時間法 終點法 通常是酶作用一段時間后 加入強酸 強堿 蛋白沉淀劑等終止酶促反應 測定這段時間內底物的減少量或產物的生成量 計算酶促反應的平均速度 連續監測法 速率法 連續監測法是指每隔一定時間 2 60s 連續多次測定酶反應過程中某一反應產物或底物量隨時間變化的數據 求出酶反應初速度 間接計算酶活性濃度的方法 適用于自動生化分析儀能動態觀測酶促反應進程 結果準確可靠 標本和試劑用量少 可在較短時間內完成測定 酶偶聯測定法 應用 對于底物或產物不能直接測定或難于準確測定的酶促反應 ExEaEiABCP 式中A為底物 B C為中間產物 P為產物 必須能夠直接測定 Ex為待測酶 Ea Ei都為工具酶 按照工具酶作用的不同 Ea又稱為輔助酶 Ei又稱為指示酶 CP稱為指示反應 問題3 在酶促反應進程中 是否任一階段的酶促反應速度都可以代表酶活性 酶促反應進程曲線 能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應速度 即酶促反應初速度 酶的含量 酶活性 酶促反應初速度 問題4 測酶活性應注意哪些方面 合適的底物與最適底物濃度底物濃度遠遠高于酶濃度理想的緩沖液與最適離子強度最適溫度最適pH合適的輔因子 激活劑濃度合理的測定時間對于固定時間法 需在酶作用一段時間后 加入合適的終止劑終止酶促反應 盡量去除各種抑制劑 問題5 如何表示酶活性大小 酶活性單位 定義 在一定條件下 一定時間內將一定量的底物轉化為產物 或得到一定量的產物 所需要的酶量 分類 慣用單位 酶活性測定方法的建立者所規定的單位 國際單位 Internationalunit IU 指在規定條件 最適pH 最適底物濃度 下 每分鐘轉化1 mol底物的酶量 單位為IU L Kat單位 指在規定條件下 每秒鐘轉化1mol底物的酶量 1Kat 6 107IU 酶的活力單位國際單位 Katal 1s轉化1mol底物的酶量臨床表示 Kings 如血清谷丙轉氨酶活力單位 每100ml血清在37 pH 7 4的條件下與底物作用60min 生成1 mol丙酮酸所需的酶量為1個活力單位酶的比活力 單位質量酶蛋白或單位體積酶制劑所含有酶活力單位數 即酶活力濃度 酶活力的測定方法1 終止測定法 定時法或終點法 2 動力學分析法 連續監測法或速率法 目錄 ONTENTS C 貳 實驗原理 叁 實驗器材與試劑 肆 實驗操作 壹 實驗目的 熟悉血清堿性磷酸酶活性的測定方法 磷酸苯二鈉法 掌握血清堿性磷酸酶測定的臨床意義 貳 實驗原理 測定ALP活性的方法主要分為兩種一是測定底物解離下的磷酸根來計算酶活力 如 甘油磷酸鈉法 但存在血清本身有磷酸根的缺點二是測定底物解離磷酸根后的羥基化合物 這種方法又可分為 酚化合物在顯色劑的作用下顯色比色測定 如本次實驗方法 生成的酚化合物本身在一定的條件下就可顯色 如對硝基苯磷酸二鈉 PNPP 法 無色的對硝基苯磷酸二鈉在ALP的作用下 生成在405nm處有特異吸收的淡黃色對硝基苯酚 通過測定在405nm處吸光度的變化速率來計算ALP的活性 磷酸苯二鈉法 在pH10環境中 ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉 苯酚在堿性溶液中與4 氨基安替比林作用 經鐵氰化鉀氧化生成醌衍生物 可根據紅色深淺測定酶活性的大小 4 氨基安替比林 鐵氰化鉀 苯酚 紅色醌亞胺衍生物 磷酸苯二鈉 H2O ALP PH 10 苯酚 磷酸氫二鈉 叁 實驗器材與試劑 一 器材 5ml移液管 1ml移液管 100或200ul微量可調式移液器 721E分光光度計 1cm比色皿 37 恒溫水浴 二 試劑 1 碳酸鹽緩沖液 0 1mol L pH10 0 溶解無水碳酸鈉6 36g 碳酸氫鈉3 36g 4 氨基安替比林1 5g于蒸餾水800ml中 將此溶液轉入1L容量瓶內 加蒸餾水到刻度 棕色瓶中貯存 2 20mmol L磷酸苯二鈉溶液先將500ml蒸餾水煮沸 迅速加入磷酸苯二鈉2 18g 磷酸苯二鈉如含2分子結晶水 則應稱取2 54g 冷卻后加氯仿2ml防腐 在4 冰箱保存 用剩的溶液不應再倒回瓶中 淡黃色結晶 熔點109 溶于水 苯和乙醇 微溶于乙醚 3 鐵氰化鉀的硼酸溶液稱取鐵氰化鉀2 5g 硼酸17g 各自溶于蒸餾水400ml中 兩液混合后 加蒸餾水至1L 置棕色瓶中避光保存 如出現藍綠色即棄去 4 酚標準工作液 0 05mg ml 購買合格的二級標準品 4一氨基安替比林用量與吸光度成正相關 需準確加入 鐵氰化鉀用量不足時 反應不完全 測量結果偏低 因此鐵氰化鉀用量必須加足或稍稍過量 本實驗采用終止法 終止劑是鐵氰化鉀硼酸液 硼酸改變了PH 使其不再處于最適PH 肆 實驗操作 立即混勻 用510nm波長 紅色醌物質的最大吸收波長 比色 以蒸餾水調零點 讀取各管吸光度 保持反應時溫度是均衡的 37 C 取試管4支 按下表操作 實驗過程兩次水浴保溫 一次5min 一次15min 前者是達到最適溫度 后者是反應時間 1 2 單擊此處編輯您要的內容 建議您在展示時采用微軟雅黑字體 本模版所有圖形線條及其相應素材均可自由編輯 改色 替換 更多使用說明和作品請詳閱模版最末的使用手冊 單擊編輯標題 單擊此處可編輯內容 根據您的需要自由拉伸文本框大小 單擊此處可編輯內容 根據您的需要自由拉伸文本框大小 注意事項 1 鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩定最后所顯色的作用 此液應避光保存 如出現藍綠色即作廢 2 底物液中不應含有酚 如含有酚時空白管顯紅色 說明磷酸苯二鈉已開始分解 不宜繼續使用 3 加入鐵氰化鉀后必須迅速混勻 為了改變PH來終止酶促反應 否則對實驗結果有影響 偏大 4 一般血清標本可以共用對照管 黃疸血清及溶血血清應分別作對照管5 目前市售的酚標準液多數為安瓿瓶 開后不能久置 計算 ALP活性 A測定 A對照 A標準 A空白 0 05 100 金氏單位 金氏單位定義每100ml血清在37 與底物作用15分鐘 產生1mg酚為1個金氏單位 參考值成人 3 13金氏單位兒童 5 28金氏單位 臨床意義 血清中ALP活力測定在臨床常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標 1 血清ALP活性升高可能原因如下 肝膽疾病 阻塞性黃疸 急性或慢性黃疸性肝炎 肝癌等 骨骼疾病 由于骨的損傷或疾病使成骨細胞內所含高濃度的ALP釋放進入血液中 引起血清ALP活性增高 如纖維性骨炎 成骨不全癥 佝僂病 骨軟化病 骨轉移癌和骨折修復愈合期等 2 血清ALP活性降低比較少見 主要見于呆小病 重癥慢性腎炎 乳糜瀉 貧血 惡病質等 另有一種遺傳性低ALP癥 因成骨細胞中缺乏ALP 引起骨中的礦物質嚴重缺乏 易發生骨折 標準曲線法 磷酸對硝基酚連續監測法以磷酸對硝基酚為底物 2 氨基 2 甲基 l 丙醇或二乙醇胺為磷酸?；氖荏w 在堿性環境下 ALP催化無色磷酸對硝基酚水解產生游離的對硝基酚 對硝基酚在堿性溶液中轉變成黃色 根據405nm處吸光度增高速率來計算ALP活性單位 反應需要Mg2 作為激活劑 立即混勻 選擇波長510nm 用零號管調零