茶中酯化型兒茶素的提取及應用一摘要 茶是相當受歡迎的飲料之一。茶對人體的保健有正面的效應。這些效應與茶中的茶多酚有關，其中最主要的物質為兒茶素類物質的單體及其衍生物，其中又以酯化型兒茶素的比例最多。 本研究的第一部分介紹以烷基乙醇分配萃取，聚酰胺及木屑吸附試驗，希望能以簡單且較安全的程序制備含低咖啡因的酯化型兒茶素精致物。在分配萃取試驗中，先將茶粉以少量的水在低濕下潤濕，再以烷基乙酯（乙酸乙酯和丁酸乙酯）進行數次分配萃取，然后以高效液相層析儀檢查有機溶劑的主要成分。其次，再以聚酰胺粉末及木屑進行吸附，然后用水將為吸附的成分洗掉，接著以不同比例的乙醇沖提酯化型兒茶素。由HPLC分析結果顯示，乙酸乙酯的精致效果較好；聚酰胺的吸附效果較好。本研究的第二部分是檢測兒茶素的體外抗氧化能力。DPPH的清除能力，與Trolox當量抗氧化能力（TEAC）。結果顯示TEAC法由于靈敏度比較高反應快，不僅可以應用于批次分析，更有可能設計成管柱后直接進行抗氧化檢測。關鍵字：茶葉，酯化型兒茶素，烷基乙酯萃取，聚酰胺吸附，木屑吸附，HPLC,抗氧化能力檢測。Abstract Tea is one of the most popular drinks.tea is helpful to our humanbeings.mostly,esterified catechins is usually used . The first part of this research is a trial to get a refined tea preparation of high esterified catechins simple and sfer processes .the procedures used including organic solvent(ethylacetate ,EA and butyl acetate ,BA)partition and polyamide or wood-dusts adsorptions .firstly ,tea powder was wetted with small amount of water ,then partitioned with the organic solvent (EA or BA )for several times .and then the composition in organic solvent examined by HPLC .secondly ,tea infusion after hot water treatment was adsorbed either treated wood-dusts or home-made polyamide power .After washing out unbound components (mainly caffeine and free or oxidized catechins),esterified catechins were then desorbed with the aqueous alcohol solution of different concentration of methanol. The results showed that EA was better than BA .on the other hand , home-made polyamide power was better than treated wood-dusts. The second part of this study is to optimizing two convenient in vitro antioxidant assay procedures (DPPH scavenging and TEAC activity).the 96-well micro-plate with ELISA reader was used for rapidly evaluating the anti-oxidative activity of the components in extract of natural product after HPLC .the results showed TEAC assay can be applied not only for batch analysis ,but may also be designed as a direct post-column assay procedure.Keywords : tea esterified catechins ,alkyl acetate partition ,polyamide ,adsorption ,wood-dust adsoption ,DPPH scavenging ,TEAC assay ,HPLC.目錄1.緒論2兒茶素的簡介2.1兒茶素的分類2.2 兒茶素的化學結構3兒茶素的保健功能與機能型4.兒茶素的制備4.1兒茶素萃取液的制備4.2 HPLC萃取液的制備4.3兒茶素的抽取4.4兒茶素的純化5.兒茶素抗氧化能力的檢測5.1兒茶素的自由基清除能力的檢測5.2 兒茶素的總抗氧化能力的檢測6.兒茶素的來源與應用7.致謝詞8.文獻二，正文1. 緒論兒茶素（catechins）1902年被發現于茶葉中，結構1925年被提出，1955至1960年之間其立體化學性質的研究報告陸續發表，從1970年左右，許多學著開始進行兒茶素生理功效的研究，至今對其在人體的吸收及功效，已經有清楚的了解.關于兒茶素，早期是以茶單寧稱之，后來發現兒茶素并無單寧的化學性質，真正的單寧可與蛋白質形成不可逆結合，但兒茶素類物質并無此性質。2. 兒茶素的簡介2.1兒茶素的分類 類物質屬于黃烷醇系列化合物，因此可統稱為黃烷醇類，又黃烷醇類屬于類黃酮類化合物之一，所以兒茶素又可稱為類黃酮素。而這一系列化合物皆屬于多酚類，姑亦稱謂茶多酚類。兒茶素類物質可細分為兩類，分別為游離型，包括：兒茶素（C），表兒茶素（EC），沒食子基兒茶素（GC，表沒食子基兒茶素（EGC），酯化型兒茶素是由游離型類兒茶素與沒食子酸進行酯化反應而成，包括：兒茶素沒食子酸酯（CG），表兒茶素沒食子酸酯（ECG），沒食子基兒茶素沒食子酸酯（GCG），表沒食子基兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等.在天然茶葉中以ECG和EGCG為主。當茶葉經高溫萃取極可能會使ECG異構化成GCG。酯化型兒茶素的化學結構中含有的羥基（OH）越多，越能阻止自由基在生物體內所造成的傷害。2.2兒茶素的化學結構兒茶素的種類繁多，其基本結構式與沒食子酰基（G）的結構式如下圖所示，G基接在基本結構式的R2位置，隨著R1,R2位置上所接官能團基的不同，有多種不同的兒茶素衍生物會出現。3. 兒茶素的保健功能及機能性 兒茶素類對于人體的生理與保健作用方面，發現其具有抗菌，抗病毒，抗炎，抗突變，抗氧化性，以及促進T和B淋巴球，自然殺手細胞的增生等功效；甚至可以降低血中三酸甘油酯與膽固醇的量，避免低密度脂蛋白LDL的氧化與粥狀動脈硬化的發生。關于目前研究出的兒茶素類物質的機能性功能如下所示：抗氧化防止油脂，肉類制品的氧化 ，防止天然色素褪色去除自由基，消除活性氧，提高體內整體抗氧化能力螯合金屬離子，降低金屬離子促氧化效應降低血脂質的氧化預防心血管疾病抗菌食品中的毒菌，蛀牙菌，植物病原菌等抗病毒流行性感冒病毒，煙草花葉病毒抑制酵素活性血管緊張素1轉移酵素，齒垢合成酵素抗突變抑制基因突變，抑制染色體異常抗腫瘤作用抑制腫瘤增值，降低腫瘤數目，降低腫瘤容積抑制以發癌劑誘導腫瘤發生抑制病毒性腫瘤發生，促進腫瘤細胞的程式化死亡抑制腫瘤細胞的增生，抑制腫瘤轉移消臭消除口臭，魚腥臭，糞便臭改善腸道菌相整腸提高腸道乳酸菌及比菲德式菌含量及比例，降低腸道無益菌及有害菌含量與果寡糖腸道菌相相乘作用其他還包括：抗過敏，防止紫外線傷害，防止放射線傷害，抑制血膽固醇，血脂質的增加，抑制血糖上升，抑制血壓上升，預防齲齒，以及減肥兒茶素類物質具有高度的抗氧化活性，對于血球抗脂質過氧化效應相當明顯。其抗氧化能力乃與兒茶素或沒食子酸為主的高親水性物質及非極性的物質等可以催化活性氧（ROS）形成酵素的活性，螯合會導致自由基形成的亞鐵等離子，或直接與ROS反應而將其清除的結果。上述這些能力，可有效的抑制生物分子（包括脂質，蛋白質和核酸等）的氧化作用，并增強免疫力，預防相關疾病，延緩衰老及瘦身等保健功效。4. 兒茶素的制備兒茶素的制備大致上可以分為萃取和純化兩個程序，萃取是利用水，乙酸乙酯，丁酸乙酯為有機溶劑將兒茶素從茶中萃取出來。然后以聚酰胺粉末和木屑的吸附純化兒茶素。這兩步經由高效液相層析法進行分析比較得最好的萃取和純化的試劑。4.1萃取液的制備 先將各茶葉如綠茶等磨成粉末狀，然后取茶粉5mg，加入80度的熱水1ml于水浴中，萃取三十分鐘。4.2 HPLC層析方法的建立 本實驗進行的設備包括泵，界面，光二級陣列偵測器。在常溫下將樣品分離，配合偵測器以280或220nm吸光值的變化進行檢測與分析。因為本實驗要分析茶中的成分以及最后得到的物質的量，因此使用20ul的loop，注射樣品量為20ul，移動相使用甲醇-醋酸，首先，以甲醇開始并緩升至30%，接著再緩升至50%，最后沖提之80%的甲醇，整個程序為36分鐘。應用于抗氧化物質的檢測的HPLC，使用1ul的loop，移動相為使用水-甲醇，梯度沖提系統先以15-30%甲醇開始，然后以甲醇開始并緩升至45%接著再緩升至50%，最后沖提之80%的甲醇，整個程序為30分鐘。4.3萃取 水-烷基乙酯分配萃取 先取10mg綠茶粉以50%甲醇500ul于溫室震蕩萃取30分鐘，當以對照組。另取10mg綠茶粉，先以純水500ul濕潤，或直接加有機溶劑乙酸乙酯或丁酸乙酯500 ul，在室溫下震蕩萃取40分鐘，經14000rpm離心10分鐘，可得有基層和水層。所得到的有基層再以100ul純水10分鐘，經14000rpm離心10分鐘，進行兩次。將所得到的有機溶劑進行真空干燥后，回溶于50%甲醇，經離心后直接進行HPLC，以分析其中的酯化型兒茶素和咖啡因的組成成分的變化。之后與本實驗已建立的兒茶素類的標準品的HPLC層析圖譜各成分的吸光光譜，波峰面積，換算出酯化型兒茶素物質的回收率。利用SephedexLH-20膠體管柱進行茶葉萃，液體預分離，經HPLC二次分離后，分別收取不同時間點的流動相，借冷凍干燥得到單一的兒茶素及酯化型兒茶素類物質。HPLC使用的移動相及分析條件如下：A液（2.5%醋酸的水溶液）與B液（100%甲醇）的混合液由開始的89：11增至70：30進行20分鐘的沖提，再由70：30增至50：50沖提至25分鐘，再由50：50增至20：80沖提至30分鐘，再以20：80沖提35分鐘，最后再回到開始的比例平衡管柱20分鐘，流速為1.2ML每分鐘結論：由HPLC的紫外檢測可得到分離的有基層中包含五種成分，并且從兩張圖譜的波峰的面積可得乙酸乙酯萃取的量高于以丁酸乙酯所萃取的量。高于以丁酸乙酯所萃取的量。萃取圖樣4.4純化木屑的吸附及沖提：取30mg木屑加入500ul綠茶粉的熱水萃取液，進行吸附，吸附后經14000rmp離心10分鐘可得未被吸附茶萃取液屑及吸附后木屑。吸附后木屑分別以500ul純水洗滌三次，以60%乙醇80%乙醇分別沖提一次即可。聚酰胺粉末吸附及沖提：取5mg聚酰胺粉末，加入500ul綠茶粉的熱水萃取液，進行吸附，吸附后經14000rmp離心10分鐘可得未被吸附茶萃取液屑及吸附后聚酰胺粉末。吸附后聚酰胺粉末分別以500ul純水洗滌一次，再分別80%乙醇分別沖提兩次即可。結論:從HPLC 紫外圖譜中可得聚酰胺的波峰面積大于木屑的面積，可得聚酰胺的吸附效果比木屑的吸附效果要好。純化圖樣5.兒茶素部分功效的檢測5.1兒茶素抗氧化能力的檢測：抗氧化物質清楚自由基的作用是由抗氧化物質提供氫離子給自由基，使自由基連鎖反應中止，讓自由基轉變為安定狀態，失去攻擊分子的能力，而抗氧化物質本身則會形成穩定的氧化性分子;兒茶素類這一類的抗氧化劑。DPPH為一種穩定的自由基，在乙醇溶液中呈現藍紫色。被常用作抗氧化指標的試驗試劑。當DPPH自由基被清除時，所呈現的顏色會由藍紫色蛻變為淡黃色；脫色程度越高，則表示DPPH自由基被清除的程度越徹底。DPPH自由基的甲醇溶液在517nm波長下有最強的吸收。因此可借由517nm吸光值的減少來代表DPPH自由基被清除的程度。測定方法是在微量離心管中先加入400ul不同濃度的Trolox標準品溶液，之后迅速加入400ulDPPH甲醇溶液（0.2mM），使最后體積成為800ul.均勻混合后于室溫下避光靜置90分鐘，而后以分光光度計檢測517nm吸光值。另外將各組凍干粉末樣品取1mg溶于1ML的5%甲醇水溶液中，以同樣的方法與DPPH試劑反應后測其吸光值。然后與標準品對照。結果：由100%或50%甲醇濃度配制的DPPH試劑，兩者之間的差異不大，由標準線的精確度可得該試劑可清除自由基。5.2TEAC活性分析 TEAC為總抗氧化能力的檢測。首先配制7mm的ABTS溶液，再加入過硫酸鉀混合均勻，在常溫避光下進行反應16小時，使之產生穩定的藍綠色ABTS+自由基水溶液，最后以水將溶液稀釋成630nm。然后以ELISA檢測儀測其吸光值。結果：從圖中可得，當甲醇濃度越高時，A630值會變差，但以水稀釋時，彼此之間的差異并不明顯。結論：TEAC 法由于靈敏度比較高反應快，不僅可以用于批次分析，更有可能設計成管柱后直接進行抗氧化活性程序的檢測。抗氧化能力的圖樣6.兒茶素類物質的來源及應用 兒茶素類物質大量存在于茶葉中。發酵是茶葉加工的主要過程，其意義是指茶葉在制造過程中，茶葉的成分_兒茶素類被氧化的比例。一般茶葉含約15-35%的茶多酚類，兒茶素類物質含約10-25%，即約占茶多酚總量70-80%左右。而幼嫩葉的兒茶素含量相對較高，粗老葉則較低；另外，大葉種(如阿薩姆茶) 含量會較小葉種(如山茶屬)高。對于兒茶素類物質在茶中的含量，是隨茶的品種，產地，生長條件加工處理條件等因素而有所差異。一般來說，綠茶等未發酵茶所含的兒茶素高于輕度發酵茶（如清茶，烏龍茶）高于全發酵茶（如紅茶）。 鑒于兒茶素類物質的眾多保健功效及顯著的抗氧化能力，其在生活中有多方面的應用。應用對象 作用 飲料及一般食品清涼飲料防止氧化，抗菌，保持香氣，增加口感，提高附加價值肉制品防止氧化，消臭，防止變色糖果口香糖防止氧化，抗菌，增加風味，防止齲齒糕餅類防止氧化，抗菌，增加風味咸干魚防止氧化，保持鮮度，防止變色食用油魚油防止氧化，消除臭味 保健食品膠囊，錠劑防止氧化，抗菌，抗病毒整腸健康飲料消除活性氧，自由基等飼料動物飼料添加劑改善動物腸道菌相，促進動物健康雞飼料添加劑降低蛋中脂肪及膽固醇含量，低膽固醇雞蛋 化妝品乳霜面膜防止皮膚過氧化，抑菌消臭藥劑兒茶素類藥劑試藥高純度兒茶素藥品藥品目前文獻資料建議每人（成人）每日的兒茶素攝取量為1-2克，由于兒茶素是非常強的天然抗氧化劑，在低劑量（20-500ppm）下既有很好的抗氧化效果，因此其添加量并不需要太高。7.致謝詞 感謝學校給了我這次機會，能夠來到嘉南藥理科技大學，同時也得感謝這個學校，它提供了我們太多的資源，在圖書館可看到各式各樣的圖書，對于兒茶素能有各方面的了解，也提供給我一個能靜下來好好讀書的環境。 這里也感謝我的同學，我的舍友，她們把論文的內容及格式準確的告訴我，讓在外讀書的我得到信息。并且她們在忙碌的生活中不忘提醒我們要交作業。