實驗二血凝及血凝抑制實驗 實驗目的 血凝試驗 滴定病毒的血凝效價 病毒的凝集價 采用一定的病毒量 通常采用4個血凝單位 血凝抑制試驗 應用標準病毒液測定血清中的相應抗體或應用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒 檢測實驗用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài) 掌握基本操作技術 了解其實用價值 實驗原理 流感病毒結構模式圖 刺突 亞型特異性抗原 易變異 血凝素 HA 從H1 H15 呈柱狀功能 吸附細胞 與細胞上受體結合 使病毒侵入細胞 凝集多種動物的紅細胞 血凝試驗 具抗原性 其抗體能中和病毒 中和抗體抑制血凝 血凝抑制試驗 血凝試驗原理 血凝素 hemagglutininHA 由病毒基因編碼的糖蛋白刺突 與病毒吸附和傳入宿主細胞有關 HA能與人或其它動物多種紅細胞表面N 乙酰神經氨酸酶受體結合引起紅細胞凝集 為病毒的紅細胞凝集反應或血凝反應 血凝原理 血凝抑制原理 血凝抑制試驗原理病毒引起的血凝現象能被相應的抗血凝素抗體所抑制 即抗體與病毒結合后 血凝素無法吸附于紅細胞表面的受體上 用免疫血清阻止紅細胞凝集的現象 稱為血凝抑制 實驗材料器材 U型或V型微量反應板 微量移液器 槍頭試劑 1 雞紅細胞 NDIV血凝素 NDIV抗血清 生理鹽水 實驗步驟1 取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上 在第1排1 10孔內加入25ul生理鹽水 第11孔不加 第12孔加25ul生理鹽水2 在第1孔內加入血凝素25ul 混勻后吸出25ul加入第2孔內 再混勻后吸出25ul加入第3孔內 依次類推至第10孔時棄掉25ul 第12孔不加作陰性對照孔 3 在1 12孔均加入25ul的生理鹽水 4 在每孔內加入25ul1 的雞紅細胞懸液 震蕩 室溫靜止感作15 30min 每5min觀察一次結果 5 計算血凝效價 稀釋使成為四價備用 血凝試驗結果判定 效價判定 凝集特別顯著 凝集現象次之 凝集清楚可見 稍顯凝集者 血凝效價 呈 凝集時的最高稀釋度 此時的稀釋度即為1個血凝單位 結果判定1 在各組對照均正確的情況下 按下列標準判定血凝反應強度示意圖 4 紅細胞呈片狀凝集 均勻布滿孔底 邊緣有時不整齊或皺縮 3 紅細胞呈片狀凝集 但面積略小于 4 2 紅細胞呈片狀凝集 但有少許沉積孔底中部呈小圓點狀 紅細胞大部分沉于孔底中央 周圍有少量散在凝集顆粒 紅細胞均沉于孔底呈小圓點狀 邊緣整齊 2 對照孔正常的情況下 紅細胞凝集100 的稀釋度為判定血凝價的終點 凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數為病毒的凝集價 血凝抑制1 取96孔V型反應板1塊置于水平實驗臺上 在第1排1 10孔內加入25ul生理鹽水 第11孔不加 第12孔加25ul生理鹽水 2 在第1孔內加入被檢血清25ul 混勻后吸出25ul加入第2孔內 再混勻后吸出25ul加入第3孔內 依次類推至第10孔時棄掉25ul 第12孔不加作陰性對照孔 3 在1 12孔內均加入 四價 血凝素25ul 震蕩后 室溫靜止作用5min 4 在1 12孔內均加入1 的雞紅細胞懸液25ul 震蕩 室溫感作15 30min 每5min觀察一次結果 5 觀測結果 記錄實驗數據 血凝抑制試驗結果判定 測定孔RBC沉于孔底中心 呈紐扣狀 凝集 病毒對照孔 凝集RBC對照孔 無自凝血凝抑制試驗效價 呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度 思考題1 病毒凝集紅細胞是不是一種特異的抗原體反應 為什么 2 血凝抑制實驗是不是特異的抗原抗體反應 為什么 3 血凝試驗中為什么要加補充液 4 為什么加病