蔗糖酶的分離提純【實驗目的】1了解蔗糖酶分離提純的方法。 2掌握離心技術、電泳技術、層析技術、膜分離技術和分光光度法?！緦嶒炘怼空崽敲窫c 32126習慣命名-D-Fructofuranosidase系統命名：-DFructofuranosideffructonydrolase。 蔗糖酶是一種水解酶，能使蔗糖水解為果糖和葡萄糖。它所催化的反應是：CH2OHHOHHHOHCH20HO蔗糖酶H OH OH H蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相當廣，在微生物、植物及動物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很豐富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。我們實驗室的研究表明采用菌體自溶法破碎酵母細胞，采用乙醇分級和DEAE-纖維素柱層析兩步分離提純步驟，就可制備純度較高的蔗糖酶制劑，而且收率也較好。從酵母中制備蔗糖酶，材料來源十分方便，而且以自己提純的酶制劑進行蔗糖酶的性質、動力學研究也十分方便?！緦嶒灢牧?、儀器和試劑】1實驗材料和試劑(1)02葡萄糖標準液；(2)3，5-二硝基水楊酸試劑；(3)新鮮啤酒酵母；(4)甲苯；(5)乙酸鈉；(6)稀乙酸溶液；(7)95乙醇；(8)DEAE-纖維素；(9)0.5molL NaOH；(10)0.5molL HCl；(11)0.005molL，pH6.0的磷酸鈉緩沖液；(12)含O.15molL NaCl的O.005molL，pH6.0的磷酸鈉緩沖液； (13)5蔗糖；(14)測定蛋白質濃度試劑；(15)聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑 2儀器 (1)恒溫水??；(2)燒杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰鹽?。?4)離心機；(5)721型分光光度計；(6)柱層析裝置；(7)天平；(8)pH計； (9)滴管、試管和血糖管；(10)秒表【實驗操作】 一、葡萄糖濃度標準曲線的制作 1取10支血糖管，按下表加入02葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水楊酸試劑：N0含糖量(mg)O2葡萄糖標準液(mL)水(mL)3,5-二硝基水楊酸試劑(mL)OD5401234567891000.40.81.21.62.02.42.83.23.600.20.40.60.81.01.21.41.61.821.81.61.41.21.00.80.60.40.23333333333 上述試劑混勻后，在沸水浴中加熱5min，取出立即冷卻，以蒸餾水稀釋至25mL，搖勻，于540nm測光密度。 2以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以光密度值為縱坐標繪制標準曲線。二、蔗糖酶的分離提純 1蔗糖酶粗品的制備 (1)自溶 稱取10克干酵母，放在200mL的燒杯中，加30mL蒸餾水攪成糊狀，再加入1.5克乙酸鈉。然后在35水浴中攪拌30min，此時會觀察到菌體自溶的現象。(2)提取及粗酶的制備 往上述自溶液中加60mL蒸餾水，將燒杯用表面皿或玻璃紙蓋好，于35保溫過夜。第二天，將自溶液于4500rmin離心20min。取出離心管，小心將上清液倒入燒杯中，棄沉淀。得到的上清液就是無細胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液體積，記錄。取2mL作為待測活力和蛋白濃度的樣品（4保存）。 2乙醇分級 將粗酶液用稀醋酸調pH至4.5。 (1)32乙醇飽和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇濃度達32時所需乙醇體積。X1/（V+X1）=O.32式中X1為所需乙醇體積，V為粗酶液的體積。然后再按X10.95換算出使乙醇濃度(按體積)達32時所需95乙醇的體積。 把粗酶液和量好體積的95乙醇在冰鹽浴中預冷(02)。小心緩慢滴加乙醇，同時不斷攪拌，一定注意不要使乙醇局部過濃，否則會引起酶變性失活。 在滴加乙醇過程中，酶液漸漸變混濁，滴加結束后，于3000rmin離心5min。上清轉移到另一燒杯中待用，棄去沉淀。(2)47.5的乙醇飽和度 按下式算出使酶液乙醇濃度達475時所需乙醇的量 X2/(V+X2)=0.475式中X2為所需乙醇體積，V為粗酶體積。再按X20.95算出需95乙醇的體積。按下式可算出使乙醇濃度達475時所需補加的95乙醇體積。 X2/0.95- X1/0.95=使乙醇濃度達475時需補加的95乙醇體積 按前述方法，繼續補加乙醇，使乙醇濃度達47.5于3000rmin離心3min，棄去上清會得少量沉淀。將沉淀用10mL pH6.0的0.005molL磷酸鈉緩沖液溶解，并對該液透析過夜或酌情縮短時間，中間換一次透析液。離心，則得到進一步純化的酶。 量出酶液體積，取出2mL，待測活力和蛋白濃度。其他酶液準備上柱。3DEAE一纖維素柱層析 (1)DEAE一纖維素處理 在使用前，將市售的DEAE一纖維素按下述方法處理：用去離子水浸泡過夜，用浮選法除去過細部分，留下30min沉積部分，重復幾次。然后用0.5molL NaOH，水，0.5molL HCl，水，0.5molL NaOH，水，交替浸泡。其中NaOH浸泡24小時，HCl浸泡半小時，每次抽濾后用水洗至中性。最后用0.005molL，pH60的磷酸鈉起始緩沖液平衡。 再生方法：用過的DEAE一纖維素可再生重復使用。但要先用0.5molL NaOH+0.5molLNaCl浸泡后再按常規處理。 DEAE一纖維素離子型。 水：R-N(CH3)2+H20=eRN+(CH3)2HOH- HCI：RN+(CH3)2HOH-+HCl=RN+(CH3)2HCl-+H20 NaOH：RN+(CH3)2HCl-+NaOH=RN+(CH3)2HOH-+Na+(2)裝柱 本實驗使用的層析柱規格為18cm(內徑)15cm(高)。 把柱子垂直固定好，可用一千錘校正，按柱層析原理部分所述方法，把DEAE一纖維素裝柱。床高距柱頂23cm為宜。用起始緩沖液洗柱，平衡過夜。注意控制流速，防止柱流干。(3)上樣 乙醇分級的酶液，經對起始緩沖液透析，離心后，按層析原理部分所述方法上樣。（注意：流速要盡量慢，使目的酶和DE52充分吸附） 樣品上完后，用起始緩沖液(130mL)洗柱。流出液流出速度為4mL5min左右。(4)洗脫 用含0.15molL NaCl的0.005molL pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗脫。洗脫速度4mL5min。收集20管即可結束。(34mL管)。 每隔一管測定活力，確定酶活力峰位置，合并，量出體積。測合并后制劑的活力和蛋白濃度。三、蔗糖酶的活力及蛋白濃度測定1蔗糖酶活力規定 在本實驗的條件下，每3min釋放lmg還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。2操作(1)樣品的稀釋 取0.2mL無細胞抽提液(E1)用pH4.6，0.2molL NaAc緩沖液稀釋40倍；取0.2mL乙醇分級酶液(E2)用上述緩沖液稀釋80倍；DEAE-纖維素柱層析酶液(E3)根據情況稀釋。 (2)反應 取兩支試管分別加入2mL稀釋的酶液。一支做對照，加0.5mL 1moLL NaOH，搖勻，使酶失活；另一支做測定管。然后把兩支試管和5的蔗糖溶液放在35C水浴中預熱恒溫。 分別取2mL 5的蔗糖加入上述兩試管中，并正確計算時間，3min于測定管中加入0.5mL1molL NaOH，搖勻，終止反應。 從反應混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3，5一二硝基水楊酸試劑和1.5mL水，搖勻。于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷卻，加蒸餾水稀釋到25mL刻度，搖勻，于540nm測光密度。 在葡萄糖標準曲線上找到所測光密度對應的葡萄糖含量，然后按下面活力計算公式計算酶活力。3酶活力計算公式 蔗糖酶活力單位：葡萄糖毫克數9酶的稀釋倍數 式中9=4.5/0.5，因酶反應液的總體積是4.5mL，而用3，5一二硝基水楊酸試劑顯色時僅取0.5mL。4蛋白濃度測定 E1稀釋20倍；E2稀釋4倍；E3不稀釋。 Bradford法測蛋白濃度(見附注1)四、酶純度鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定E1、E2和E3的純度。具體操作(見附注2)?！窘Y果的處理】 樣品樣品總體積 ml總活力 蛋白濃度 mg/ml 總蛋白量 mg 比活 u/mg 提純倍數無細胞抽提液(E1)乙醇分級E2)DEAE一纖維素柱層析(E3)附實驗1 Bradford法測定蛋白質含量 【實驗目的】 掌握考馬斯亮藍G250法測定蛋白質含量的原理和方法。 【實驗原理】 在蛋白質的分離、純化過程中，往往需要有一種快速、靈敏的方法對蛋白質進行定量測定。近年來被廣為采用的Bradford法滿足了人們的需要。本方法采用考馬斯亮藍G250(Coomassilebrilliant blue，G250，簡稱CBBG250)作為染色物質。依其存在形式不同可表現為紅色和藍色，當CBBG250單獨存在時為紅色；當其與蛋白質結合后，其顏色變為藍色。藍色的深淺與溶液中的蛋白質含量(01000g/mL)成正比，故可用于測定蛋白質含量。 該方法快速、重復性好、干擾因素少，CBBG250在2分鐘內即可完全與蛋白結合，并在l小時內保持穩定，該反應幾乎不受鈉、鉀等陽離子干擾，更不受蔗糖等碳水化合物的于擾。但較高濃度的十二烷基硫酸鈉，Triton x一100等對其有干擾，此影響可通過選擇適當的對照來消除?！緦嶒瀮x器與試劑】 1儀器 (1)臺稱 (2)721分光光度計 (3)容量瓶 (4)刻度試管和吸量管 2試劑 (1)考馬斯亮藍G250溶液：稱取CBB-一G250 lOOmg溶于50mL 95的乙醇溶液中，然后加入100mL 85的磷酸，最后加蒸餾水定容至1000mL。 (2)標準蛋白質溶液(100g/mL)：精確稱取100mg牛血清白蛋白，用0.9氯化鈉溶液定容至1000mL。 (3)生理鹽水【實驗操作】1制作標準曲線取6支試管，按下表操作管試 別 劑 空 白 1 2 3 4 5 標準蛋白質溶液(mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 生理鹽水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 CBB-G250溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混勻，放置2min，于595nm處比色，記錄光密度值(OD值)。以蛋白質含量為橫坐標，光密度值(OD值)為縱坐標，繪制標準曲線。 2樣品測定取2只試管，按下表操作：管試 別 劑 樣品管 空白管 稀釋的未知樣品(mL) 1.0 生理鹽水(mL) 10 CBB-C250溶液(ml) 5.0 5O 混勻，放置2min，于595nm處比色，查標準曲線，求得蛋白質含量。注：樣品用生理鹽水稀釋。 附實驗2聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的純度【實驗目的】 掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法和原理。【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下，聚合交聯而成的三維網狀結構的高分子聚合物，其網孔大小可由凝膠濃度加以調節。因此用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物時，被分離物質由于所載電荷及其分子大小和形狀的差異，在電場作用下以及凝膠網孔的“分子篩”作用下產生不同的移動速度而互相分離。所以此方法具有電荷效應和“分子篩”效應的雙重特性。因為這一方法具有設備簡單、操作方便、時間短、樣品用量少、不易擴散等優點，所以它是鑒定酶和分離蛋白質的有力工具。【實驗儀器與試劑】1儀器(1)SCR型穩流穩壓電泳儀(2)垂直板電泳槽及附件(3) 10mL注射器、100L、10L移液器(4)微量注射器、燒杯、移液管(5)真空泵2試劑(1) pH8.9 Tris-HCl緩沖液（1號）：稱取Tris 36.6g，lmolL HCl 48 mL，TEMED 0.23mL，加重蒸餾水定容至100mL。(2)凝膠貯液（2號）：稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸餾水分別溶解，定容至100mL，過濾，棕色瓶4貯存可使用2周。(3) 0.14%過硫酸銨(3號): 稱取(NH4)2S206 0.14g，加重蒸餾水定容至100mL(現用現配)(4) pH6.7 Tris-HCl緩沖液(4號)：稱取Tris 5.98g， lmolL HCl 48 mL，TEMED 0.46mL，加重蒸餾水定容至100mL。(5) 電極緩沖液(pH8.3)：稱取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g，加重蒸餾水定容至1000mL， pH為8.3（使用時稀釋10倍）。(6) 0.1%溴酚藍指示劑：(7) 染色液：考馬斯亮藍R250 0.25g，甲醇227mL，冰乙酸46 mL，加蒸餾水定容至500mL。(8) 脫色液：甲醇50mL，冰乙酸75 mL，加蒸餾水定容至1000mL?！緦嶒灢僮鳌?1分離膠的制備（7.5%）：1號貯液：2號貯液：蒸餾水：3號貯液按l：2：1：4配制(TEMED 20l) 將1、2及水按比例混好后置于三角瓶中，再放在真空干燥器中，同時將3液也放在真空干燥器中減壓排溶液中的氣泡。抽氣后立即按比例加入3號液，用玻璃棒輕輕攪拌使之混合。用滴管將其沿管壁注入到已用瓊脂封好的垂直板凝膠模具兩玻璃夾層中，注意要緩慢，避免產生氣泡。當凝膠溶液頂部距玻璃板上端4cm時為止，然后在凝膠溶液頂部輕輕加約0.5cm厚的蒸餾水層，當夾層中的凝膠與水層之間出現清晰的界面時，表明凝膠聚合作用已完成，通常需0.5-1h。2濃縮膠制備（3%）： 4號貯液(1.25mL), 2號貯液(1.0mL), 3號貯液(8mL) (TEMED 15L)混勻，將分離膠頂部的水層吸出，把配好的濃縮膠加到分離膠上面，再將梳板插到濃縮膠層，靜置，待凝膠聚合后，于室溫放置半小時以上方可使用。3加樣 小心取出梳板，用濾紙條吸去槽內水分，于兩電極槽內加入電極緩沖液，用微量加樣器加樣，每孔各加20l左右，最多可加100l。注：E1、E2、E3各100L加200L 40%蔗糖，再加50L溴酚藍混勻上樣20L。E3若含量低可200L。4電泳 加樣后，打開電源開關，將電流調50mA，當染料進入濃縮膠與分離膠界面時將電流調至75mA，電壓100-200V，待染料遷移至距凝膠下端約1cm時，停止電泳。電泳時間約4-4.5h。5染色和脫色 將凝膠放入染色液中，過夜。次日，倒出染色液，用蒸餾水洗凝膠數次后，放入脫色液中，更換脫色液，直至背景清晰。附實驗3 蔗糖酶米氏常數的測定【實驗目的】 了解底物濃度與酶反應速度之間的關系，學習求蔗糖酶米氏常數的方法?！緦嶒炘怼?測定米氏常數最常用的方法是雙倒數作圖法：1Km1SVmaxVmax1實驗時，選擇不同的s，測定相應的v，求出兩者的倒數，以1/s為橫坐標，以1/為縱坐標作圖，繪出一條直線(圖1)，外推至橫軸相交，橫軸截距即為-1/Km。此法由于方便而應用最廣，但亦有缺點，實驗點過分集中于直線的左端，因而作圖不易十分準確。 1/ 斜率Km/Vmax 1/Vmax -1/Km 1/s【實驗儀器與試劑】1儀器(1)721分光光度計；(2)恒溫水??；(3)試管、吸量管、秒表、坐標紙、血糖管2試劑 (1)0.1 molL蔗糖溶液；(2)0.2 molL NaAc緩沖溶液(pH4.6) (3)1molL NaOH溶液，2molL NaOH溶液 (4)3，5一二硝基水楊酸試劑 稱取10g 3，5一二硝基水楊酸溶于200mL 2molL NaOH中，加入300g酒石酸鉀鈉4H20，再用去離子水稀釋至2000mL?！緦嶒灢僮鳌?1取試管10支，按110編號，1號為空白。 2按下表將蔗糖溶液，醋酸緩沖液分別加入10支試管中，于35水浴中保溫10min。 3取約25mL酶液，放入同一水浴中保溫約10min。 4于各管中依次按同樣時問間隔(1min或2min)加人已保溫過的酶液2mL，計時，立即搖勻，在35水浴中作用5min。 5按同樣次