生物技術制藥1.大分子和小分子藥物的區別大分子：多肽蛋白，來源于生物體，不容易提純；小分子：為化學小分子，來源于化學合成，容易提純。2.有哪些方法合成第二鏈cDNA。1）selfpriming；2）Replacementsynthesis。3.有哪些引物用來合成cDNA第一鏈1）oligodT(n=1218)，它引導的cDNA合成必須從3開始；2）隨機引物（n=6），隨機合成610寡核苷酸片段作為引物；3）基因特異性引物（n=1825），當RNA序列或部分序列已知時。4.與RTPCR相比，建立的cDNA文庫有什么好處。1）cDNA文庫是以mRNA為材料，排除了真核基因組內含子的干擾，而且對于一些RNA病毒來說，cDNA文庫是研究它們的唯一可行的方法；2）cDNA基因文庫的篩選簡單易行；3）由于每一個cDNA克隆都代表一種mRNA序列，這樣在選擇中出現假陽性的幾率比較低；4）cDNA是雙鏈可以克隆到載體上，能無限擴增，可以隨時滿足需要，RTPCR的產物第一鏈cDNA為單鏈，不能擴增，一旦用完就沒有了。5.在哺乳動物細胞中表達常用的啟動子。SV40、CMV、MLP6.逆轉錄病毒載體的主要結構。1）2個LTR（長末端重復序列）（其插入宿主基因組作用，5還有啟動子作用）；2）（裝配信號，指導結構蛋白表達）；3）MCS（多克隆位點）；4）backbone（大腸桿菌中增殖必備部分）。7.哺乳動物細胞表達載體的主要表達元件。啟動子、載體的轉錄終止信號和高效多聚腺苷酸（ploy(A)）加尾信號、選擇標記基因。8.什么是轉染？在完成基因克隆之后，大多數的研究人員希望重新把這個基因的自然體和突變體導入到各種細胞來分析它的功能特點，這個過程稱之為轉染。9.有哪些轉染哺乳動物細胞的方法？（一)非病毒介導轉染法：1）鈣轉染法（沉淀）；2）脂質體轉染法（形成雙層質膜包埋DNA）；3）DEAE葡聚糖轉染技術促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA）；4）電轉染（在高壓電脈沖作用下使細胞膜上出現微小孔洞，促使細胞吸收）；5）壓縮DNA轉染法（將DNA壓縮成為小顆粒）；6）利用細胞周期轉染法（利用G2/M周期細胞分裂時細胞膜的空隙增大）；7）顯微注射法（直接將目的基因通過注射器注入受體細胞中）；8）提高轉染率（提高細胞內的激酶的pH）；（二）病毒介導轉染法：逆轉錄病毒介導法，病毒介導法（通過感染宿主細胞將外源基因整合到染色體中）。10.什么是裝配細胞？指細胞中含有逆轉錄病毒結構蛋白基因，能夠表達病毒的結構蛋白，是逆轉錄病毒載體轉染入細胞后能夠合成具有感染型的病毒粒，這種細胞稱為裝配細胞。11.舉例兩個報告基因并說明原理。1）半乳糖甘酶基因（lacZ）：利用它可以進行藍白斑篩選，大腸桿菌產生的半乳糖甘酶能夠催化乳糖水解為單糖，是xgal第五變藍色；2）螢火蟲熒光素酶基因：在Mg2+、ATP、O2的參與下催化熒光素氧化脫羧，產生激活態的氧化熒光素，并放出光子，產生550580nm的熒光，通過測定熒光酶基因表達檢測各種啟動子活性，它可以克隆啟動子下游，定量測定啟動子效率；3）細菌熒光酶：以脂肪醛為底物，在還原型黃系單核苷酸及氧的作用下，在脂肪醛氧化成脂肪的同時發出光子，產生490nm的熒光。12.胰島素的結構。胰島素含有51個氨基酸，有兩條多肽連組成，即A鏈（21aa）和B鏈（30aa）,兩個多肽鏈間由兩個二硫鍵連接，這兩個二硫鍵分別位于A7B7和A20-B19，第三個二硫鍵由A鏈之間的A6A11組成。13.胰島素的主要功能。主要為促進合成代謝，調節血糖穩定，主要靶器官為肝臟、脂肪組織、骨骼肌。1）對糖代謝的調節：吸收血糖，合成糖原；2）對脂肪代謝的調節：加速葡萄糖轉變為脂肪酸；3）對蛋白質代謝的調節：增加蛋白質合成，抑制蛋白質分解。14.干擾素的三個主要亞型。1）干擾素：白細胞是主要合成場所，其主要功能為：增強免疫力，預防和治療；2）干擾素：有成纖維細胞合成，其主要功能為：抗病毒，免疫調節；3）干擾素：有淋巴細胞合成，其主要功能為：較強的抗病毒作用，抗細胞增殖和免疫調節作用。15.干擾素的三大功能。1）抗病毒；2）抗腫瘤；3）免疫調節。16.紅細胞生成素的主要生理功能。EPO能調節紅素祖細胞，紅細胞的生成，治療作用：1）治療因慢性腎功能衰竭引起的成年和兒童貧血癥病人貧血癥；2）治療由疊氮胸苷處理HLV感染所致的貧血；3）治療非骨髓惡性腫瘤病人因化療引起的貧血癥。17.ADCC解釋抗體依賴的細胞介導細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞通過識別抗體的Fc端直接殺傷被抗體包被的靶細胞。18.名詞解釋：VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3、CDR。VL：為輕鏈的可變區，位于IgL鏈N端月1/2處，約含108111個氨基酸，其氨基酸組成和排列順序在不同抗體間有很大變化。CL：輕鏈恒定區，位于IgL鏈C端1/2處，約含105個氨基酸，氨基酸組成和序列無大的變化。VH：重鏈可變區，位于IgH鏈N端1/51/4相互，約由118個氨基酸組成，在不同抗體間氨基酸組成和排列順序變化很大。CH1：重鏈第一恒定區，重鏈恒定區的一個球狀結構域，是重鏈正鏈的第二個亞單位。遺傳標記所在區。CH2：重鏈第一恒定區，重鏈恒定區的一個球狀結構域，是重鏈正鏈的第三個亞單位。補體結合所在區，抗體糖基化部位。CH3：重鏈第一恒定區，重鏈恒定區的一個球狀結構域，是重鏈正鏈的第四個亞單位。能與細胞表面的Fc受體結合行使抗體功能。CDR：互補決定區。VH和VL的三個高變區共同組成Ig的抗原結合部位，該部位形成一個與抗原決定簇互補的表面，故高變區又稱為CDR，分別用CDR1、CDR2、CDR3表示。19.CDR的數量和功能。1）數量：Ig輕鏈有三個CDR：LCDR1、LCDR2、LCDR3，Ig重鏈有三個CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3；2）功能：CDR的Aa順序決定抗體的特異性，CDR是Ig的抗原結合部位。20.Fab和F(ab)2的區別。1）Fab是由木瓜蛋白每水解IgG鉸鏈區二硫鍵連接的2條重鏈的近N端而得到的，F(ab)2是由胃蛋白酶水解IgG鉸鏈區二硫鍵連接的二條重鏈的近C端而得到的；2）Fab片段為單價，F(ab)2片段為雙價；3）Fab片段與抗原結合后，不能形成凝集反應或沉淀反應，F(ab)2片段與抗原結合后，可以發生凝集反應或沉淀反應。21.抗體糖基化的部位。CH222.什么叫HAMA的反應。人抗鼠抗體反應，由于鼠抗體對人體而言具有較強的免疫原性而產生的。23.為什么要人源化鼠抗體？1）鼠單抗對人而言具有較強的免疫原性，可產生較強的人抗鼠抗體反應，而人源化鼠抗體可以最大強度降低抗體的鼠原性，降低甚至消除人體對抗體的排斥反應；2）鼠單抗的生產成本較高，難于大規模普及應用，而鼠抗體人源化后可采用原核細胞、真核生物或植物等多種表達系統大量生產，成本大大降低。24.抗體可變區的結構。1）高變區，又稱互補決定區，在輕鏈和重鏈上各分為三個區域，分別為LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3；2）骨架去，VH和VL各有四個骨架區，分別用FR1、FR2、FR3、FR4表示，它們夾持著CDR，可變區3個CDR分別被FR1、FR2、FR3、FR4隔開。1.用逆轉錄病毒介導DNA的過程。病毒基因編碼在一條單鏈RNA分子上，進入細胞后逆轉錄為雙鏈DNA并整合在細胞染色體，以此為模板合成病毒基因及子代RNA，再裝配成病毒顆粒。2.調節胰島素分泌的主要物質。1）血糖；2）氨基酸和脂肪酸；3）激素；4）神經調節。3.有哪些辦法解決HAMA反應。1）減少單克隆抗體多鼠源部分；2）嵌合抗體；3）單克隆抗體的人源化；4）改型抗體；5）CDR移植；6）鼠源性抗體的改造即鼠抗體的人源化。4.重組抗體與單克隆抗體的區別。5.在噬菌體展示中那些蛋白可與展示多肽融合，并說明道理。抗體基因與p或p基因相融合。轉染表達F菌毛的大腸桿菌，抗體融合表達在p的N端，在輔助噬菌體超感染后p融合蛋白被包裝于噬菌體尾部。6.Etanercept/Enbrel/可溶性TNF受體的設計和治療機理。表皮生長因子受體是跨膜糖蛋白，屬于型受體酪氨酸激酶，不斷有許多正常上皮組織如皮膚和毛囊上皮組織所表達出來。可特異性的與正常腫瘤細胞的表皮生長因子結合，阻斷磷酸化作用和與受體相關聯激酶的活性，抑制細胞生長，誘導細胞死亡，并減少基質金屬蛋白酶和血管內皮生長因子的生產。7.發現藥物基因和靶標的策略。1）通過篩選同源基因的方法發現新的藥物基因或藥物靶基因；2）通過RNA的表達篩選新的藥物基因和靶基因；3）蛋白組學；4）使用寡核苷酸技術證實藥物分子；5）基因功能的系統分析；6）使用生物模型發現新藥。8.研究中流顯像抗體制劑，有哪些方法可將抗體與同位素連接？9.自然狀態的胰島素易發生沉淀，用什么方法解決的？鏈第28，第29位的脯氨酸和賴氨酸發生了轉換。這些變化導致胰島素間的自我集合性降低，因此皮下注射吸收快，與正常的人胰島素相比，效應峰出現早，滯留時間短，持續時間長。10.InsulinGlargine（甘精胰島素）的設計與作用原理。重組人胰島素類似物，作用時間長達24小時，它利用重組DNA技術，以實驗室的大腸桿菌為生產菌。它與人的胰島素的不同之處在于A鏈第23位上的氨基酸以甘氨酸替代丙氨酸并且在B鏈的C端加上兩個精氨酸。它的分子量大約為6.1kD。在生理pH條件下，InsulinGlargine與天然胰島素相比，溶解性略差，在Lantus注射液中，它是全溶的。當皮下注射到組織后，有一定超過24h的穩定的濃度/時間值，并且沒有明顯的峰值；它的特點是皮下注射后吸收慢，胰島素血漿濃度值平緩，吸收模式與在皮下注射是相似的。11.InsulinAspart（門冬胰島素）的設計與作用原理。來自rDNA，是速效人胰島素類藥物，通過重組DNA技術在Saccharomycescerevisiae（baker酵母）中生產的，分子量為5.8kD。主要用于調節葡萄糖的代謝。在人體該胰島素類似物的皮下注射于普通的胰島素相比，作用起效快、作用時間短。在B28位上以天冬氨酸替代脯氨酸，降低了該分子像通常胰島素那樣形成六聚體的能力。Novolog與普通胰島素相比，兩者吸收基本上相同。12.基因工程疫苗的種類。1）合成多肽疫苗；2）亞單位疫苗；3）基因缺失疫苗；4）重組活載體疫苗；5）核酸疫苗；6）其他疫苗。13.談談核酸疫苗的原理和優缺點。（一）原理：模擬了病毒的自然感染過程。DNA質粒在注射部位被肌細胞攝取后，通過所含的啟動子和增強子系統調節合成所編碼的蛋白質，合成的蛋白質被細胞內蛋白酶復合體降解成含抗原表位的肽段，進入內質網與MHC類分子結合，然后被轉運系統遞呈到細胞膜表面，此復合體共同激活CD8+CTL，部分被分泌或釋放到血的蛋白質，激活特異性B細胞，從而產生保護性抗體，另外分泌的蛋白質被巨噬細胞或樹突狀細胞等專職抗原遞呈細胞俘虜，被加工成肽段，進入溶酶體/內體區與MHC類分子結合，激活手MHC分子限制的CD4+Th細胞，被激活的Th細胞分泌IFN、IL2等細胞因子，進一步促使和強化體液免疫和細胞免疫；（二）優缺點：1）基因疫苗能在宿主細胞中產生外源基因；2）具有共同的理化性質，可在同一載體上構建表達多種抗原；3）核酸疫苗接種后，蛋白質抗原在宿主細胞內，可直接與MHC類和MHC類分子結合，引起廣泛的細胞免疫和體液免疫，且不存在返祖的危險；4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表達載體在細胞內進行抗原表達，與病毒活疫苗相比避免了病毒本身存在的毒力反強和病毒基因組整合到宿主染色體的危險；5）設備簡單；6）由于核酸疫苗作為重組值里，能在工程菌內快速大量增殖，且提取方便、可是生產成本降低，并能加工干燥，便于運輸和儲藏。14.a-alfacon(infergen)的設計原理。一種重組的非天然的型干擾素。IFNcon1的166個氨基酸序列是通過若干天然IFN亞型的序列，將各個相應位置最常出現的氨基酸組合設計而成。額外改變了4個氨基酸以促進分子構建，其相應的DNA序列采用化學合成法構建。15.a-n1(Wellferon)的設計原理。用Sendai感染成淋巴細胞系而合成的干擾素。16.蛋白藥物聚乙烯二醇化作