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文檔簡介
第五章 基因克隆載體,1,基因克隆載體定義 通過不同途徑將承載的外源DNA片段(基因)帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。,2,1. 載體的功能 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件,3,2.必備條件 1、克隆位點(一個或多個) 2、能攜帶外源DNA片段進入受體細(xì)胞: 能自我復(fù)制,或整入染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。 3、有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因 4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞) 意義:基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起,構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。,4,按克隆載體的來源分: 質(zhì)粒 病毒或噬菌體 質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的 質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的,分 類,5,第一節(jié) 質(zhì)粒克隆載體 定義: 以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體,適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫和cDNA基因文庫。,6,一、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì),、組成與構(gòu)型 是染色體外裸露的雙鏈DNA分子(細(xì)菌、真菌、藍藻、綠藻),7,構(gòu)型:,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,ccc,8,、分子大?。?100102 kb,9,、復(fù)制 特點: 在宿主細(xì)胞內(nèi); 單向; 質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)控制,拷貝數(shù)(宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值),10,()每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定 嚴(yán)緊控制型:1-數(shù)個拷貝;大質(zhì)粒 松馳控制型:10個以上拷貝;小質(zhì)粒。 經(jīng)氯霉素處理,宿主中質(zhì)粒大量擴增(如ColE1拷貝數(shù)達3000個)。,11,()質(zhì)粒復(fù)制的控制因素 cop基因:指令宿主合成阻遏物,當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時,阻遏物也合成積累,直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。,12,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,、質(zhì)粒的不親和性 (閱讀教程p88,新版p105:兩種解釋) 親和性質(zhì)粒:能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒 不親和性(不相容性)質(zhì)粒:不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒,不能同時存在于一個細(xì)胞中 意義:受體細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒,最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒,14,、質(zhì)粒遷移(質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性),(1)含tra基因合成細(xì)胞表面物質(zhì)(鞭毛) 質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞,革蘭氏陰性菌的質(zhì)??煞殖蓛纱箢悾?接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞(接合作用),含tra基因的質(zhì)粒,如F、Ti質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用,不含tra基因的質(zhì)粒,如Col、R的其它成員,15,()遷移作用 某些非接合型質(zhì)粒(ColE1)在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下,也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移,這個過程由 bom 和mob 基因決定。 不含tra基因而含bom(ori)位點的質(zhì)粒,當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時,即可打開ori位點,非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱,16,、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒,顯性(表達型)質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀,這種質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)粒; 隱蔽質(zhì)粒即使宿主內(nèi)含有某種質(zhì)粒,但無異樣性狀表露,這種質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒,17,顯性質(zhì)粒 質(zhì)粒:含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥物的抗性基因,可作為選擇標(biāo)記。 Col質(zhì)粒 質(zhì)粒 降解質(zhì)粒 i質(zhì)粒 隱蔽質(zhì)粒 藍藻內(nèi)源質(zhì)粒,18,二、 質(zhì)??寺≥d體構(gòu)建的基本策略 、能進行有效復(fù)制復(fù)制起始位點(最好是多拷貝) 、克隆位點組裝MCS連桿 、選擇標(biāo)記基因抗性基因,Lac Z基因 、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高) 15kb,轉(zhuǎn)化率 、組裝各種“元件”,如啟動子、終止子等,19,三、質(zhì)粒克隆載體構(gòu)建 過程:嚴(yán)密的實驗設(shè)計構(gòu)建(切割、修飾和連接重組) 構(gòu)建原則 1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒:含必備的元件,如ori、選擇標(biāo)記、克隆位點、啟動子和終止子 2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件 3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因 4、選用合適的啟動子 5、構(gòu)建過程力求簡單,20,代表性實例 (一)pBR322及其衍生質(zhì)??寺≥d體的構(gòu)建 、pBR322構(gòu)建 質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322” p:質(zhì)粒(plasmid ) BR:兩位主要構(gòu)建者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首 322:實驗編號,21,22,pBR322構(gòu)建過程(出發(fā)質(zhì)粒:pMB1),23,pBR322的三個親本:pMB1、pSF2124、pSC101 識別位點: Apr基因區(qū)(3個 ): Pst、Sca 、Pvu Tcr基因區(qū)(7個 ):BamH 、Scal 、EcoR、 Sph 、Nhe 、Nru 、Xma Tcr啟動子區(qū)(2個 ):Cla 、Hind pBR322分子大?。?363bp,24,25,26,優(yōu)點: (1)較小的分子量 10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂,pBR322易于自身純化,且可克隆6kb左右的外源DNA (2)帶有一個復(fù)制起始位點 保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細(xì)胞中行使復(fù)制的功能。 (3)較高的拷貝數(shù) 經(jīng)氯霉素擴培后達10003000 copys/cell,該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便 (4)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。插入失活(圖解),27,28,、pUC18/19質(zhì)粒載體 命名pUCUniversity of California的科學(xué)家首先構(gòu)建。 與pBR322區(qū)別: 乳糖操縱子的一個DNA片段(lac Z基因)替換Tcr基因; 組裝了一個多克隆位點(MCS)連桿,29,pUC包括四個組成部分: (1)pBR322的復(fù)制起點(ori) (2)Apr基因,但DNA序列發(fā)生變化,不再含原來限制性核酸內(nèi)切識別位點 (3)lacZ基因 (4)在lacZ基因內(nèi)部靠近5端有一段MCS連桿,30,31,pBR322衍生的質(zhì)粒 缺失bom位點 pBR325、 pBR327, pAT153,不具被動遷移作用,更安全,32,Lac Z篩選機制: 含乳糖操縱子的啟動子、調(diào)節(jié)因子和 -半乳糖苷酶的N端146殘基(-肽) 合成有活性的 基因(lac Z)的質(zhì)粒載體+可編 -半乳糖苷酶 碼C端部分殘基的宿主(與Lac Z互補 的大腸桿菌) 在含IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷)和 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖) 藍色菌落 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 在N端-肽的編碼區(qū)插入MCS 不影響lac Z基因功能 插入外源DNA 滅活lac Z基因 白色菌落,33,編碼b-半乳糖苷酶,IPTG,X-gal,(酶的底物),lac promoter,藍色菌落,IPTG可誘導(dǎo)lacZ形成肽鏈,該產(chǎn)物能與有缺陷的宿主細(xì)胞所編碼的C-末端發(fā)生基因內(nèi)互補,形成有活性的-半乳糖苷酶,分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍色。 當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點后, 使其編碼的肽鏈?zhǔn)セ钚? 使其不能形成-互補, 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。,34,重組子的顯色互補篩選法,35,-互補的原理,所謂基因內(nèi)互補作用,在LacZ體系中,是指二個彼此互補的突變基因(突變體1只含LacI和LacZ的N端145個氨基酸的肽;突變體2缺乏LacZ的N端肽),它們編碼產(chǎn)生的無活性的多肽產(chǎn)物,但由于二個突變體之間通過肽互補作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性, 進而可分解底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)而產(chǎn)生半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-氯-青定藍, 使菌落呈現(xiàn)出藍色反應(yīng)。然而,當(dāng)外源基因DNA片段插入載體中LacZ 肽區(qū)段的多克隆位點后, 就會阻斷序列的讀碼結(jié)構(gòu), 使其編碼的肽失去活性, 使重組子所在的細(xì)菌不能完成-互補, 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng),可以檢測和篩選出攜有外源基因重組子克隆。此法又稱藍白篩選法。如圖,非重組質(zhì)粒: 不含有插入的 DNA藍色菌落 重組質(zhì)粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落,非重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒,37,38,pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點 (1)分子量更小、拷貝數(shù)更高 (2)免疫組化法一步實現(xiàn)篩選鑒定重組體,省時 (3)MCS區(qū)方便轉(zhuǎn)移外源DNA在不同載體系列中 “穿梭”,使具有兩種不同粘末端的外源DNA 能直接克隆入pUC載體,39,(二)藍藻質(zhì)粒克隆載體pPKE2的構(gòu)建 大腸桿菌質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)化藍藻 藍藻內(nèi)的質(zhì)粒屬隱蔽質(zhì)粒 即:大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起始點 + 藍藻源質(zhì)粒復(fù)制起始點 pPbs(1511bp) pPbs Cla 重組 pPRS-1 多次亞克隆 pPKE2 pBR322 組裝CaMV35s啟動子、MCS、rbcS終止子、Kmr基因,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒,40,41,(三)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建 Ti質(zhì)粒:根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤(冠癭瘤)的質(zhì)粒,故稱Tumor inducing plasmid(Ti質(zhì)粒)。 雙鏈環(huán)狀DNA分子,200250kb。,42,1、4個功能區(qū):T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū) (1)T-DNA區(qū) Ti質(zhì)粒進入植物細(xì)胞的只有約25kb部分,即T-DNA(transfer DNA)。左右邊界各有一個25bp正向重復(fù)序列(LTS和RTS)稱為邊界序列,為T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列,中間序列被外源DNA片段替換,仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中。 這是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。,43,(2)Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)上游,其表達產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移,顯示致瘤性。 (3)Con區(qū) 含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra),可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化,使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移,也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。 (4)Ori區(qū) 復(fù)制起始區(qū),調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。 Ti質(zhì)??寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌,農(nóng)桿菌只起中介作用。,44,Ti質(zhì)粒作為載體的問題 i) 太大,無適合克隆位點 ii)T-DNA的存在不能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整植株 故不能達到直接選育轉(zhuǎn)基因植物的目的,45,2、構(gòu)建途徑 (1)取代型載體 用大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體取代Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA序列而構(gòu)建。外源基因以同源交換而重組。 Onc- Ti:T-DNA上的onc基因被取代而構(gòu)建。 Onc+ Ti:pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留onc基因而構(gòu)建。進入植物細(xì)胞誘發(fā)冠癭瘤。,46,(2)中間質(zhì)??寺≥d體 將T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構(gòu)建。 共整合克隆載體系統(tǒng)(T-DNA同源序列、bom 位點) 雙元克隆載體系統(tǒng)微型Ti質(zhì)粒,47,(四)乳酸桿菌質(zhì)??寺≥d體 乳酸桿菌:G+,非致病,益生菌,用于食品和飲料。 乳酸桿菌質(zhì)粒:小質(zhì)粒,宿主范圍廣泛,可用于其它G+菌及大腸桿菌。 乳酸桿菌質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建: 用于其它G+菌及大腸桿菌; 乳酸桿菌本身對km、Ap抗性較強。 標(biāo)記基因: 選用lacZ,如有pLJ1復(fù)制啟始位點的pBG10 選用ery,如有p353-2復(fù)制啟始位點的pP3537,48,(五)酵母2m質(zhì)粒克隆載體 幾乎所有釀酒酵母中都存在,(1)2m質(zhì)粒結(jié)構(gòu) a、環(huán)狀分子內(nèi)有反向重復(fù)序列IR1和IR2,可發(fā)生重組,形成A、B型質(zhì)粒;有ori復(fù)制起始點能自主復(fù)制。,圖3-10 A型酵母2m質(zhì)粒,b、2080個/細(xì)胞。有絲分裂時數(shù)目穩(wěn)定,減數(shù)分裂時形成cir+/cir0,49,(2)YEp克隆載體(酵母游離型質(zhì)粒) 2m質(zhì)粒的ori EcoR酶切 pBR322質(zhì)粒 酵母染色體URA3基因Hind酶切 YEp24,50,特征 (1)保留了pBR322的和篩選大腸桿菌克隆子 (2)含URA3標(biāo)記篩選酵母菌克隆子 (3)URA3基因補償酵母菌ura3突變 優(yōu)點 (1)是一種穿梭質(zhì)粒,可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)制 (2)轉(zhuǎn)化率高,1gDNA可獲得約104105個克隆子 (3)穩(wěn)定高拷貝復(fù)制 故可用酵母菌高水平表達外源目的基因,51,(六)TA克隆載體針對PCR產(chǎn)物的克隆,故可研制一種線性載體,其5端各帶一不配對T,可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進行克隆,即TA克隆。,原理 PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性作用下,于3端加一非配對的A。,52,53,TA克隆,54,2019/10/26,55,TA載體的再生方法 (1)克隆載體線性化 (2)克隆載體末端補平反應(yīng) (3)克隆載體末端加T反應(yīng) 注:再生后的TA載體,原線性化的酶切位點消失,56,5-GGCTGGCTGG NNNCAGGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3,LB,5-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3,RB,圖 T-DNA的LTS核苷酸序列(LB)和RTS核苷酸序列(RB),57,MCS連桿,58,第二節(jié) 病毒(噬菌體)克隆載體,病毒基本結(jié)構(gòu): DNA(或RNA)+ 外殼蛋白 感染細(xì)菌的病毒,稱為噬菌體 分類(根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系) 溫和性病毒: 溶原性增殖構(gòu)建病毒載體 烈性病毒: 溶菌性增殖改造后,59,一、噬菌體克隆載體,(一) 噬菌體性質(zhì) DNA + 外殼蛋白 1、DNA (48.5kb) 噬菌體中:線性 宿主細(xì)胞:環(huán)狀(cos位點),60,2、噬菌體基因組有基因50個以上,J與N、P與Q之間為非必需序列,61,3、 限制性核酸內(nèi)切酶位點: 56種(p477) 4、 噬菌體的生長途徑 溶菌生長途徑 溶原生長途徑宿主合成int基因產(chǎn)物-DNA整合到染色體DNA上 某種脅迫條件下合成six基因產(chǎn)物-DNA脫離細(xì)菌染色體溶菌,62,(二)構(gòu)建依據(jù) 1、噬菌體是一種溫和噬菌體 2、能承載較大的外源DNA片段 野生型DNA頭部可包裝約36.451kb(自身的75%105%),且約有20kb DNA可缺失(生長非必需) 3、在DNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點,63,(三)構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 策略: 切去部分非必需區(qū) 刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點 插入選擇性標(biāo)記基因 建立體外包裝系統(tǒng),64,技術(shù)路線 1、用限制性酶切去非必需區(qū),抹去多余識別位點 選定一種酶,以gtWES 為例,EcoRI (48.5kb) DNA E co R I 6個片段,65,B片段是噬菌體生長非必需的; C片段缺失可阻斷溶原生長途徑,但不影響溶菌途徑; E片段去掉min5序列(2.6kb)。 兩端EcoR I別點經(jīng)點突變或甲基化處理,即得gtWES:(48.5-5.5-2.6 = 40.4kb) 克隆能力: 替換B: 最大:51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小:36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 實際應(yīng)用時克隆能力略有出入(p109,表3-5),66,2、在DNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 (1)自然篩選(51kb或36.4kb不能包裝) (2)插入選擇標(biāo)記基因 取代red和gam基因 野生型噬菌體(Spi+表型) 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長 (red、gam基因) 外源DNA取代 獲Spi-表型 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長 red、gam基因 局限性:只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體 最常用的篩選標(biāo)記:Lac Z基因,67,3、建立重組DNA分子體外包裝系統(tǒng) 體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后,才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。 野生型噬菌體感染的細(xì)胞中無多余的外殼蛋白。( 見教材解釋:新版p115) D-(D基因缺失噬菌體)受體細(xì)胞積累除D蛋白以外所有蛋白質(zhì) E-(E基因缺失噬菌體)受體細(xì)胞積累除E蛋白以外所有蛋白質(zhì) 混合 D、E互補 包裝DNA分子 噬菌體 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-),68,(四) 噬菌體克隆載體的應(yīng)用 1、建立c DNA基因文庫 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過程。效率高。 轉(zhuǎn)染(transfection) 指真核細(xì)胞主動或者被動導(dǎo)入外源DNA 片段而獲得新表型的過程。 2、克隆外源目的基因,69,(五)重組DNA分子的體外包裝(自學(xué)),1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的檢驗 2、制備包裝物 3、體外包裝,70,(一)構(gòu)建策略 由質(zhì)粒和含cos位點的DNA片段組裝成的載體,即cosmid克隆載體,又叫粘粒; 或:cosmid克隆載體是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體質(zhì)?;旌衔?。,二、cosmid克隆載體(柯斯質(zhì)粒載體),71,(二) cosmid的特征 (教材新版p118) 1、環(huán)形雙鏈DNA分子, 36.4kb, 一般10kb 2、具有質(zhì)粒的性質(zhì),可轉(zhuǎn)化大腸桿菌,并按質(zhì)粒方式復(fù)制 3、含有一個cos位點 A蛋白 cos末端體外包裝成為噬菌體,但不含噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng),不會產(chǎn)生子代噬菌體,72,4、cosmid較小,可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb,則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA,且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。 因此,cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。,73,(三)柯斯克隆(Cosmid cloning),(1)定義 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體,在大腸桿菌寄主細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù),叫做柯斯克隆。 這個定義的三個要點是: a.柯斯質(zhì)粒作載體; b.大腸桿菌為寄主; c.克隆大片段的真核基因組DNA。,74,(2)理論依據(jù),a.在phage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補的單鏈突出序列,即所謂的粘性末端(cos位點) b.phage的多連體分子是由cos連接而成的。 cos cos cos cos cos cos c.末端酶(treminase)或叫Ter體系即phage具有一種位點特異的切割體系(site-specific cutting system).A蛋白 *此系統(tǒng)能識別兩個相距適宜的(36.451kb)cos位點,并切割之。 *根據(jù)上述分析可知phage DNA包裝的兩個必要條件是:cos位點、Ter體系(A蛋白),75,(3)柯斯質(zhì)粒包裝條件,由于只有在被作用的DNA分子具有兩個cos位點,而且它們之間距離保持在36.451kb的條件下,Ter體系才能對它發(fā)生作用。 據(jù)此推斷: 柯斯質(zhì)粒是不能作為包裝體系的,因為它只有一個cos位點。 因此:柯斯質(zhì)粒只有在同適當(dāng)大小的外源DNA片段重組成具有兩個cos位點而且相距達36.451kb之間時,才能被包裝。(見應(yīng)用新版p119),76,利用Cos質(zhì)粒進行克隆,77,(四)使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì),可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 利用cosmid的噬菌體性質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞(下圖),78,三、M13噬菌體克隆載體(單鏈絲狀噬菌體載體 ),79,含復(fù)制起始位點及可插入外源DNA的位點,(一)M13 DNA 環(huán)狀單鏈DNA分子(“+”鏈DNA) 大小:6.4kb 結(jié)構(gòu):10個區(qū) 基因間隔區(qū)(IS區(qū)),80,(二)M13DNA復(fù)制和M13噬菌體增殖 M13 DNA“+”鏈進入雄性大腸桿菌 合成“-”鏈產(chǎn)生雙鏈M13 DNA復(fù)制型DNA(RF-DNA 按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制,同時以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)譯包裝蛋白 RF-DNA達200拷貝時,單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈 結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈 “+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體 擠出受體細(xì)胞 受體細(xì)胞不被溶菌。,81,82,83,M13 DNA復(fù)制特征:以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物高速離心上清中含噬菌體顆?!?”鏈DNA 沉淀菌體破碎后,可提取RF-DNA,84,(三)M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑 策略:在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因,并組裝合適 RF-DNA上有10個BsuI位點部分酶切獲得全長線形RF-DNA, 與含LacZ標(biāo)記的Hind酶切片段進行平末端連接M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點,可在Lac Z區(qū)插入連桿 構(gòu)建成對M13載體,保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。,85,86,(四)M13克隆載體的優(yōu)點與應(yīng)用 優(yōu)點: 1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制,可與質(zhì)粒一樣體外純化操作 2、制備的M13 DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌,直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 3、單鏈DNA不受包裝限制,可包裝M13 DNA分子6倍的DNA分子 4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子 主要用途:克隆、分離單鏈外源DNA片段 獲得的“+”鏈可直接用于DNA測序,87,MCS連桿,88,89,90,91,第三節(jié) 染色體定位整合克隆載體,質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足: 1、外源DNA的不穩(wěn)定性 2、外源DNA插入染色體DNA位點的隨機性,92,基因整合平臺系統(tǒng)基因定位同源重組(基因打靶) 整合平臺:即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域,是外源DNA 定位整合的位置 定位整合克隆載體:除一般質(zhì)??寺≥d體必備的元
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