3.3 DNA聚合酶 DNA聚合酶 ：能夠催化脫氧核糖核苷酸連續加到雙鏈DNA分子引物鏈的游離3-OH末端，使核苷酸發生聚合作用，而不從模板上解離。 反應特點 ： (1) 以四種三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）為底物 (2) 反應需要模板的指導，加入的核苷酸由模板鏈所決定 (3) 聚合反應需要有引物存在，且引物要有3-OH游離基團 (4) DNA鏈的生長方向為5 3 (5) 產物DNA鏈的性質與模板相同（半保留復制）,DNA聚合酶只能在已有的核酸鏈上延伸DNA鏈，而不能從無到有開始DNA鏈的合成。 種類 ： 到目前為止，已從E.coli 中發現了Pol I、Pol II、Pol III三種DNA聚合酶 。其中Pol I 和Pol II的主要功能是參與DNA的修復過程，Pol III與DNA的復制有關。三種聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆關系密切。,3.3.1 大腸桿菌DNA聚合酶 I（E.coli DNA Pol I） DNA Pol I是從大腸桿菌細胞中分離得到的，該酶是由單一多肽組成的球蛋白，MW=109000，直徑=65 DNA Pol I已得到高度純化，從100 kg大腸桿菌中可以分離到約500 mg純化的酶蛋白。每個成熟的大腸桿菌細胞中約有400個分子的Pol I。,1. DNA Pol I在空間結構上有三個位點： (1) DNA模板結合位點結合模板 (2) 核苷酸-磷酸結合位點結合引物 (3) dNTP結合位點結合底物,2. DNA Pol I是一種多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 催化單核苷酸逐個地結合到DNA模板的3-OH末端，沿著引物的3-OH方向按模板順序從5 3延伸。 每分子DNA pol I每分鐘可以催化約1000個核苷酸的聚合。,(2) 5 3的外切酶活性 只作用于雙鏈DNA（dsDNA） ，從5端切割下一個個單核苷酸。,(3) 3 5的外切酶活性 能從游離的3末端降解單鏈DNA（ssDNA）成為單核苷酸，通常對雙鏈DNA不作用。,在正常聚合條件下，該酶對dsDNA的3 5外切酶活性受到5 3聚合酶活性的抑制。但一旦出現錯配堿基時，聚合反應立即停止，由3 5外切酶迅速除去錯誤進入的核苷酸，然后聚合反應才得以繼續進行下去。所以3 5核酸外切酶活力被認為起著校對功能，對DNA復制的忠實性極為重要。,3. E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途: (1) 可用于填補dsDNA上的缺口，以便有效地進行DNA重組 (2) 用于DNA序列分析 (3) 用于制備DNA探針 在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶I的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發生。當外切酶活性從缺口的5一側移去一個5核苷酸后，聚合作用就會在缺口的3一側補上一個新的核苷酸。隨著反應的進行，5一側的核苷酸不斷地被移去，3一側的核苷酸又按序地增補，于是缺口便沿著DNA分子按合成的方向移動缺口平移（Nick Translation）。,應用缺口平移法制備DNA雜交探針，其典型的反應體系是：在25 l總體積中含有1 g純化的特定的DNA片段，并加入適量的DNase I、pol I、32PdNTP和未標記的dNTP。 脫氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一種內切酶，它能夠水解單鏈或雙鏈DNA，形成帶有5-磷酸末端的單（寡）核苷酸。,由于32PdNTP比較昂貴，所以一般都采用低濃度的32PdNTP（2 mol/L）和高濃度的未標記的dNTP（20 mol/L）。而且就大多數實驗的要求，使用一種32PdNTP就足夠了，其他3種均可采用未標記的dNTP，或是用適量的未標記的dNTP稀釋每種32PdNTP。 改變反應體系中DNase I的數量，可以控制32PdNTP的參入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP參入DNA鏈。,3.3.2 大腸桿菌DNA聚合酶 I的Klenow片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment） 用蛋白酶將DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量為75000 dal和36000 dal的兩個片段，大片段即稱為Klenow片段，它具有5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 3的核酸外切酶活性。 Klenow聚合酶可以標記DNA片段末端（5延伸末端）。,對于限制性核酸內切酶EcoR I切割后形成的5延伸末端可用32PdATP標記： 而BamH I切割后形成的5延伸末端可用32PdGTP標記：,3.3.3 T4 DNA聚合酶 是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中分離純化的一種特殊的DNA聚合酶。 1. T4 DNA聚合酶也是一種多功能酶： (1) 5 3的聚合酶活性 (2) 3 5的外切酶活性 其外切酶活性比E.coli DNA Pol I 的活性高200倍。 (3) 取代反應活性 如果在反應混合物中僅存在一種dNTP，則此酶的3 5外切酶活性將從dsDNA的3末端降解，直到互補于這個dNTP的堿基出現為止，然后在這一位置發生取代反應。,2. T4 DNA聚合酶在基因工程中的應用 (1) 以填充反應標記帶有5延伸末端的dsDNA片段 (2) 將DNA的3延伸末端切成平末端 (3) 以取代反應標記帶有3延伸末端或平末端的dsDNA片段 (4) 以部分消化dsDNA法標記DNA片段作為雜交探針（鏈特異的探針）,3.3.4 逆轉錄酶 是一種有效的轉錄RNA成為DNA的酶，又稱RNA依賴的DNA聚合酶，其產物DNA稱cDNA，即互補DNA。 1. 逆轉錄酶也是一個多功能酶： (1) RNA依賴的DNA聚合酶 以RNA鏈為模板，以帶有3-OH末端的DNA片段為引物，沿5 3方向合成DNA鏈。 幾乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成為逆轉錄酶很好的模板，由此可合成cDNA。,(2) DNA依賴的DNA聚合酶 以ssDNA為模板，以帶有3-OH末端的DNA片段為引物，沿5 3方向合成DNA鏈。 可在新合成的DNA鏈上合成另一條互補DNA。,(3) 外切RNA酶活性 底物是RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，其水解方向有兩種： * 從RNA鏈 5末端外切：稱5 3外切RNA酶 * 從RNA鏈 3末端外切：稱3 5外切RNA酶 2. 逆轉錄酶在基因工程中的應用： 主要用途是轉錄真核生物的mRNA成為cDNA，從而制備基因片段。,3. 商品化的逆轉錄酶有兩種： (1) 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）逆轉錄酶 (2) Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆轉錄酶 AMV逆轉錄酶雖能更有效地拷貝復雜的mRNA，但它有很強的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆轉錄酶的外切RNA酶活性較弱，更有利于制備全長的cDNA。 兩種逆轉錄酶均無3 5外切DNA酶活性，故不具備校對功能，在高濃度dNTP和Mn2+存在下，容易出現核苷酸錯誤摻入。,3.4 DNA和RNA的修飾酶 3.4.1 核酸酶SI 1. 作用特點： 此酶是從米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又稱單鏈特異性酶，其降解產物是5-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。,核酸酶SI對DNA底物的活性比對RNA強。高濃度的核酸酶SI可從缺口（nick）或小裂縫（gap）處降解dsDNA。 2. 作用條件： 需要Zn2+作為輔助因子，最適pH是4.5，這是與基因工程的其它工具酶不同的兩個特點。 3. 在基因工程中的應用： 由于核酸酶SI能從DNA片段中切除單鏈尾巴，因而在質粒的重建和DNA重組中被廣泛使用。 切除單鏈粘性末端，產生平末端，再用T4連接酶連接。 切除cDNA的發夾結構。,3.4.2 末端脫氧核苷酸轉移酶 1. 作用特點： 此酶是從小牛胸腺中提取的，可催化單核苷酸轉移到另一個DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是帶3-OH末端的ssDNA （Mg2+為輔因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在時才能作引物。 2. 在基因工程中的應用： 在連接平末端DNA片段時加上互補的同源多聚物（同聚物加尾法）。,3.4.3 外核酸酶III 1. 作用特點： 此酶是從E.coli中分離得到的，是一種從dsDNA的3-OH末端降解產生5單核苷酸的外切酶。 2. 在基因工程中的應用： 產生具有5延伸末端的DNA片段 制備特異的DNA探針,3.4.4 外核酸酶Bal 31 1. 作用特點： 此酶是從乳白短桿菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以漸進的方式從線型DNA分子的3，5兩端同時降解，產物是單核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是帶延伸末端或是平末端的dsDNA，對3、5兩端的降解速度相同。 2. 作用條件： 降解時需要Ca2+作輔助因子，以EDTA作螯合劑，可使Bal 31失活。,3. 在基因工程中的應用： 可用于組建DNA的物理圖譜，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。,3.4.5 T4多核苷酸激酶 1. 作用特點： 此酶是從噬菌體T4感染的E.coli中分離的。能催化ATP的-磷酸轉移到DNA或RNA的5-OH末端上。,2. 在基因工程中的應用： 可用于缺乏5-磷酸的待連接DNA片段的5端磷酸化：反轉錄mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR擴增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在與克隆載體連接之前，需用T4多核苷酸激酶將DNA的5-磷酸化。,3.4.6 堿性磷酸化酶（堿性磷酸酯酶） 1. 作用特點： 從細菌中分離的堿性磷酸化酶簡稱BAP，從小牛腸中分離的簡稱CAP。它能特異性地切去DNA或RNA的5-磷