第三章 蛋白質工程 Protein Engineering,主講教師 林娜 碩士,主要講授內容： 1 概述 2 蛋白質的結構基礎 3 蛋白質工程的研究方法 4 蛋白質工程技術的應用 5 蛋白質組學,本章要求： 了解蛋白質的基礎結構 理解蛋白質的研究方法 了解蛋白質的運用 了解蛋白質組學,在自然界中，構成生命最基礎的物質有： 蛋白質 最重要 核酸 最根本 多糖 脂類,各種生命功能、生命現象、生命活動都和蛋白質有關,1 概述 1.1 蛋白質,蛋白質很重要具體表現在：,1）蛋白質執行著酶的功能 2）通過激素調節代謝作用 3）產生相應的抗體 4）構建各種生物膜,1.2 蛋白質工程,蛋白質工程就是在蛋白質的結構與功能為基礎，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，定向地改造天然的蛋白質，甚至創造新的、自然界本不存在的、具有優良特性的蛋白質分子。 蛋白質工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。,2.1 蛋白質的一級結構（primary structure) 2.1.1 定義 指氨基酸按一定的順序通過肽鍵相連而成的多肽鏈，也是蛋白質最基本的結構。 2.1.2 Anfinsen原理 每一種蛋白質分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結構，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結構，也就是蛋白質的一級結構決定了蛋白質的二級三級等高級結構,2 蛋白質的結構基礎,2.1.3 等電點,蛋白質顆粒的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。 當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質游離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子（凈電荷為O)，此時溶液的pH值稱為蛋白質的等電點pI)。,2.1 蛋白質的一級結構,2.2 蛋白質二級結構（secondary structure）,2.2.1 定義 二級結構是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結構的構象，是多肽鏈局部的空間結構（構象） 2.2.2 主要形式 -螺旋、-折疊、-轉角等,四種不同的螺旋,在平行（A）和反平行（B）折疊片中 氫鍵的排列,反向折疊,RNase的一些二級結構,2.3 三級結構（tertiary structure）,三級結構主要針對球狀蛋白質 是指整條多肽鏈由二級結構元件構建成的總三維結構,胰島素的三級結構,2.4 四級結構（quaternary structure）,四級結構是指在亞基和亞基之間通過疏水作用等次級鍵結合成為有序排列的特定的空間結構。 四級結構的蛋白質中每個球狀蛋白質稱為亞基,血紅蛋白的四級結構,2.5 蛋白質分子間的相互作用,亞基間的聚合可以被解離，可以重新聚合 四級結構的蛋白質分子亞基間可以雜交 多肽與蛋白質分子間可以聚合,2.6 蛋白質空間結構分析 蛋白質工程的核心內容之一就是收集大量的蛋白質分子結構的信息，以便建立結構與功能之間關系的數據庫，為蛋白質結構與功能之間關系的理論研究奠定基礎。 蛋白質數據庫，HPDB數據庫 蛋白質空間結構預測，如 Homology 等軟件分析,常用蛋白序列和結構數據庫,PDB蛋白質三維結構 SWISS-PROT蛋白質序列數據庫 PIR蛋白質序列數據庫 OWL非冗余蛋白質序列 EMBL核酸序列數據庫 TrEMBLEMBL的翻譯數據庫 GenBANK核酸序列數據庫 PROSITE蛋白質功能位點 SWISS-MODEL從序列模建結構 SWISS-3DIMAGE三維結構圖示 DSSP蛋白質二級結構參數 FSSP已知空間結構的蛋白質家族 SCOP蛋白質分類數據庫 CATH蛋白質分類數據庫 Pfam蛋白質家族和結構域,2.7蛋白質結構與功能的關系,2.7.1 結構決定功能 必須基團、非必須基團 2.7.2 如何利用結構執行特定的功能的呢？ 正逐步被揭示,3 蛋白質工程的研究方法 3.1蛋白質工程的研究策略,反向生物學技術 根據對天然蛋白質結構與功能分析建立起來的數據庫里的數據，可以預測一定氨基酸序列肽鏈空間結構和生物功能； 反之也可以根據特定的生物功能，設計蛋白質的氨基酸序列和空間結構。,序列功能預測流程圖,蛋白質結構預測流程圖,3.2 蛋白質全新設計,3.2.1 設計目標的選擇 3.2.2 蛋白質設計技術與方法 序列最簡化法 3.2.3 改變現有蛋白質的結構 3.2.3.1 基本步驟 3.2.3.2 人工定點突變 M13載體法 PCR法,4 蛋白質工程技術的應用,4.1 胰蛋白酶 4.2 金屬硫蛋白 4.3 人白細胞介素-2 4.4 組織纖溶酶原激活因子 4.5 枯草桿菌蛋白酶,金屬硫蛋白 （Metallothionein) ，簡稱MT,含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子 MT分子呈橢圓形，分子量為6500道爾頓，兩個結構域拼接在一起，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收，構象較堅固，具有較強的耐熱性。,4.2 金屬硫蛋白,金屬硫蛋白的六大功能,1)清除體內自由基、防止機體衰老：MT是體內清除自由基能力最強的一種，其清除羥自由基的能力約為SOD的10,000倍 2)解除重金屬的毒性：MT的巰基基團（-SH）能強烈螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳等 3)參與體內微量元素的代謝：在體內，MT可根據體內微量元素的狀況對鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘的吸收、儲存、運輸和釋放等進行精細調節，使機體達到最佳生理狀態。,4.2 金屬硫蛋白,4)增強機體對各種不良狀態的適應能力：當機體處于各種不良狀態時，體內MT含量增加，從而提高鋅、銅、錳、鐵、鉬、硒、鈷、碘等微量元素的濃度，機體適應能力隨之增強。 5)鋅元素的貯存庫：每100毫克鋅金屬硫蛋白含6.9毫克鋅，肝、腎中的鋅元素主要是以金屬硫蛋白的形式貯存。 6)防止細胞癌變：MT可消除自由基、重金屬（砷、汞、鎘、鉻、鎳）、烷化劑、電離輻射以及紫外線對DNA、RNA、酶、蛋白質以及細胞膜的損傷，從而可以防止它們的致癌、致突變作用,4.2 金屬硫蛋白,從1978年到2019年共舉行了四次國際專題研討會，我國將MT列入863重大攻關計劃，2019年列入國家級火炬計劃。 結果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、美容護膚、減輕吸煙及環境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。,結構域的拼接,5 蛋白質組學（Proteomics） 2019年的Science雜志已把蛋白質組學列 為六大研究熱點之一，其“熱度”僅次于干細胞研究,5.1 人類蛋白質組計劃概述,2019年，國際人類蛋白質組組織宣告成立。 一項是由中國科學家牽頭執行的“人類肝臟蛋白質組計劃”； 另一項是以美國科學家牽頭執行的“人類血漿蛋白質組計劃”，由此拉開了人類蛋白質組計劃的帷幕。,5.2 蛋白質組學研究的研究意義和背景,隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學研究已進入了后基因組時代。在這個時代，生命科學的主要研究對象是功能基因組學，包括結構基因組研究和蛋白質組研究等。 2019年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質組研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF ),5.3 蛋白質組學的研究內容包括：,5.3.1 蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結合Western等技術，利用蛋白質芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術對蛋白質進行鑒定研究。 5.3.2 翻譯后修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯后修飾如磷 酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質調節功能的重要方式。 5.3.3 蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結合分析，基因表達產物-蛋白質的功能分析。另外對蛋白質表達出來后在細胞內的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質功能的了解。熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具。 5.3.4 分子醫學的發展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質，而很多藥物的靶分子也是蛋白質。藥物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用。,5.4 蛋白質組學研究技術,5.4.1 蛋白質組研究中的樣品制備 5.4.2 蛋白質組研究中的樣品分離和分析 雙向凝膠電泳質譜技術、二維色譜 (2D-LC)、二維毛細管電泳 (2D-CE)、液相色譜毛細管電泳 (LC-CE),5.5 蛋白質組學發展趨勢,在基礎研究方面，蛋白質組研究技術被應用到各種生命科學領域 在應用研究方面，蛋白質組學將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一 在技術發展方面，蛋白質組學的研究方法將出現多種技術并存，各有優勢和局限的特點,5.6 蛋白質組學在臨床研究中的應用,臨床蛋白質組學是將蛋白質組學技術應用于臨床醫學研究，它主要圍繞疾病的預防、早期診斷和治療等方面