中山市粵爾生物技術有限公司 YE-11-01氟苯尼考（Florfenicol）ELISA檢測試劑盒說明書一、 原理本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氟苯尼考和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氟苯尼考抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氟苯尼考的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物氟苯尼考的含量。二、 試劑盒技術指標交叉反應率氟苯尼考100%氟苯尼考胺4.1%甲砜霉素 1%氯霉素 0.1% 三、 試劑盒組成1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb3、 酶標記物 12ml4、 抗體濃縮液 7ml5、 底物 A液 7ml6、 底物 B液 7ml7、 終 止 液 7ml8、 20X濃縮洗滌液 40ml9、 2X濃縮復溶液 50ml四、 所用儀器、試劑具備的儀器：微孔板酶標儀、氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）微量移液器：單道 20l-200l、100l-1000l、多道 250l試 劑：乙酸乙酯、正己烷。五、 樣本前處理步驟樣本處理前須知處理任何樣本時，都必須注意：（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染，干擾實驗結果。樣本前處理需配制：配液1：將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復溶液+1份去離子水，用于樣本提取后的復溶)（a）組織 (雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法1、 用均質器均質組織樣本；2、 稱30.05g樣本于離心管中，加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；3、 取出2ml上層液體在50-60下氮氣/空氣吹干或旋轉蒸發儀蒸干4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復溶液強烈振蕩30s，室溫4000r/min以上離心15min。5、 取50 l下層相用于分析。樣本稀釋倍數：1 （b）蜂蜜1、 取20.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml2、 去離子水溶解；3、 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min；4、 室溫4000r/min以上離心10min；5、 移取1ml上層乙酸乙酯（相當于0.5g樣本）到另一離心管中，50-60氮氣流下干燥；6、 用0.5ml稀釋后的復溶液溶解，混合30s；7、 取50l用于分析。8、 樣本稀釋倍數：1 檢測下限：0.5ppb9、 定量下限：1.5ppb 六、 酶標免疫分析程序 測定前應須知：1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25）。2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8。3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。操作步驟1、 從4冷藏環境中取出所需試劑，置室溫（20-25）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、 取出需要數量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8。3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、 加標準品/樣本 50l/孔到各自的微孔中，然后加抗體50l/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25環境中反應60min。6、 取出將孔內液體甩干，用洗液250l/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。7、 每孔加入酶標記物100l，蓋板膜蓋板后置25環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 8、 顯色：每孔加入底物A液50l，再加底物B液50l，輕輕振蕩混勻，25環境中避光顯色30min。9、 測定：每孔加入終止液50l，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。七、 結果判定所測得的標準液和樣品吸光度的平均值除以第一個標 準液（0標準液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0標準液的百分吸光度值等于100%。標準液的吸光度值（或樣品）-100 = %吸光度值0標準液的吸光度值以標準品濃度的以10為底的對數為X軸， 百分吸光值為Y軸，繪制標準曲線。將樣本的百分吸光值代入標準曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數，即為樣品中所含AOZ的量。 若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。八、檢測方法靈敏度、準確度、精密度 試劑盒靈敏度：0.5ppb 樣本最低檢測限：蜂 蜜 1.5ppb雞肉/雞肝、豬肉/豬肝、蝦、魚0.5ppb 回收率： 雞肉/雞肝、豬肉/豬肝、蝦、魚90%10%蜂蜜85%10%精密度： 試劑盒的變異系數均小于10%九、注意事項1、 室溫低于20或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25）會導致所有標準的OD值偏低。2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。3、 試劑混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、 不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。6、 將不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、 試劑變質的跡象顯色液若有任何顏色表