1、帕金森病,掌握內容 1.概念：帕金森??；基因修飾細胞 2.帕金森病的病理表現及發病的病理學基礎 3.基底神經節環路的調節方式 4.帕金森病的發病機制,2,PPT學習交流,一、定義,帕金森?。≒akinsons Disease, PD）又名震顫麻痹（paralysis agitans），由Parkinson（1817）首先描述，是一種進展緩慢，原發于黑質-紋狀體通路的錐體外系變性疾病。臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常為主要特征。,3,PPT學習交流,臨床表現 肢體震顫 肌強直 運動遲緩 姿勢平衡反射消失 其他癥狀,Monograph by James Parkinson 181

2、7,4,PPT學習交流,流行病學,PD在60歲以上人群中患病率為1000/10萬，并隨年齡增長而增高，兩性分布差異不大 是一種常見的中老年人神經系統變性疾病,5,PPT學習交流,病理,主要病理改變是含色素的黑質致密部DA能神經元變性、缺失 出現癥狀時DA能神經元常丟失50%以上，癥狀明顯時神經元丟失嚴重，殘留者變性，黑色素減少 以黑質、紋狀體減少為主，皮層和下丘腦并不減少,6,PPT學習交流,病理改變,7,PPT學習交流,PET顯示PD腦內DAT功能顯著降低,8,PPT學習交流,病理,胞漿內出現特征性嗜酸性包涵體-Lewy小體，a-突觸核蛋白是Lewy小體中重要成分 類似改變也見于藍斑、中縫核

3、、迷走神經背核等，程度較輕,9,PPT學習交流,病理特點,總之，典型病理特點是： 進行性黑質含色素多巴胺神經元大量喪失(50%70%) 路易(Lewy)小體有a-突觸核蛋白沉積,10,PPT學習交流,病理改變,a. 黑質萎縮 b. 與正常對照比較,Parkinson病 a.黑質致密部Lewy體，H&E b.改良Bielschowsky銀染技術,11,PPT學習交流,生化病理,腦內存在多條DA遞質通路，最重要為黑質-紋狀體通路 左旋酪氨酸 TH L-DOPA DDC DA 該通路DA神經元在黑質致密部，正常時自血流攝入左旋酪氨酸，經細胞內酪氨酸羥化酶(TH)轉化為左旋多巴(L-DOPA) 再經過

4、多巴脫羧酶(DDC)轉化為DA DA通過黑質-紋狀體束作用于殼核和尾狀核細胞,12,PPT學習交流,Levodopa Mechanism,13,PPT學習交流,黑質-紋狀體多巴胺系統功能紊亂，多巴胺含量顯著減少(80% 99%) 該生化異常與臨床癥狀嚴重程度成正比 PD發病的病理學基礎：黑質-紋狀體多巴胺能神經環路,14,PPT學習交流,生化病理-基底節的神經生化解剖簡圖,DA神經元對紋狀體GABA源性遞質釋放起抑制作用,ACh神經元對紋狀體GABA源性遞質釋放起興奮作用,15,PPT學習交流,生化病理-帕金森病基底節神經生化病理學,DA神經元變性(黑圈及虛線)破壞紋狀體GABA神經元的多巴胺

5、抑制與ACh興奮的平衡 凈效應是增加紋狀體GABA釋放,16,PPT學習交流,帕金森病生化病理,17,PPT學習交流,病因及發病機制,本病病因迄今未明-原發性PD (idiopathic Parkinsons disease)。 發病確切機制還不完全清楚，20世紀80年代以后，對PD發病機制的研究有兩個突破性發展：其一基底核神經回路的平衡失調成為PD發病的病理基礎；其二DA氧化應激學說成為黑質部位DA神經元退化的理論基礎。,18,PPT學習交流,一、基底神經節環路與帕金森病 錐體外系的運動調節中心區：基底神經節 運動調節的關鍵遞質：多巴胺 基底神經節（basal ganglia）包括：紋狀體

6、（striaturn, corpus striaturn）、黑質 （substantia nigra, SN）、丘腦底核和杏仁核。,19,PPT學習交流,基底神經節的主要功能：控制肢體肌張力，全身運動協調，維持姿勢調節反射和下運動神經元的反射控制 基底神經節損害：肌張力不全運動增多綜合征或肌張力增高運動減少綜合征,20,PPT學習交流,基底神經節接受來自大腦皮層有關運動區的傳入沖動，基底神經節的傳出沖動又通過丘腦返回皮質的特定區域，構成了5條不同通路的皮質-基底節-丘腦-皮質反饋的神經環路。 基底神經節環路的調節方式：直接通路；間接通路；黑質-紋狀體多巴胺通路。,基底核調節運動的神經回路,22

7、,PPT學習交流,（一）直接通路 皮層谷氨酸能神經元 紋狀體GABA神經元釋放GABA遞質 蒼白球GABA神經元 丘腦對谷氨酸神經元抑制作用 谷氨酸釋放增加 皮層運動神經元活性增加。 （二）間接通路 皮層谷氨酸能神經元 紋狀體GABA神經元釋放 GABA遞質 蒼白球GABA神經元 丘腦底核的谷氨酸能神經元纖維投射到蒼白球的神經興奮性 蒼白球的GABA神經元釋放增加 丘腦谷氨酸能神經元興奮性降低 皮層運動,興奮,抑制,減弱,興奮,抑制,抑制,23,PPT學習交流,（三）黑質-紋狀體多巴胺通路 直接環路：D1受體介導的，GABA/肽類神經 遞質(SP)/強啡肽(DYN)參與的調 節環路，起興奮調節

8、效應 。 間接環路：D2受體介導的，GABA/腦啡肽 (ENK)/神經營養素(NT)參與的調 節環路，起去抑制調節效應。 二者易化運動效果，相互協調作用，平衡錐體外系運動功能。,24,PPT學習交流,T,Dopamine: Inhibitory Ach: Excitatory GABA: Inhibitory,DA neuron generated,三、PD的發病機制 （一）環境因素與PD發病 參與PD發病的物質： （1）N-甲基氨基-L-丙氨酸（L-BMMA ） （2）長期接觸銅、錳、鐵、鉛或長期暴露 于殺蟲劑 （3）N-甲基1,2,3,6四氫吡啶（N-methyl- 4-phenyl-1,

9、2,3,6-tet-rahydro-pyridine， MPTP ）,26,PPT學習交流,（二）多巴胺(DA)的氧化應激學說與 PD發病 腦內生成的自由基可以攻擊腦內的多巴胺神經元，使之產生神經細胞的退化性病理變化。 氧化應激損傷是黑質多巴胺神經元死亡的主要原因，導致氧化應激損傷增高的可能原因：外源性毒物的侵入；DA的氧化應激代謝；神經黑色素的存在；清除自由基的能力不全。,27,PPT學習交流,1、DA的氧化應激代謝 在DA的代謝過程中，77%DA被星形神經膠質細胞內的單氨氧化酶B( MAO-B )所氧化，23%DA被神經元內MAO-A氧化代謝。在O2存在的情況下，此MAO-A催化DA代謝為

10、34-雙羥苯乙酸（DOPAC）的同時生成過氧化氫（H2O2），DOPAC在單胺氧化酶甲基轉移酶的作用下代謝生成高香草酸（HVA）。 在生理的條件下，DA的酶促反應代謝較快。但在氧化應激的條件下，神經細胞內的DA可通過非酶促反應來進行代謝，在鐵離子的參與下，反應加快，被氧化生成醌類衍化物，并進一步形成黑色素。,28,PPT學習交流,多巴胺在神經元中的酶代謝及其代謝產物,29,PPT學習交流,在DA代謝過程中，產生超氧陰離子（O2-）和H2O2；此外，多巴胺又可以被代謝形成6-羥基多巴（6-hydroxyldopamine, 6-OHDA），后者又可以作為單胺類神經遞質的化學切割劑進一步損傷多巴胺

11、神經元。 該途經生成的H2O2通過Fenton反映，形成羥基和羥自由基。 H2O2 + Fe3+ OH - + OH,30,PPT學習交流,2、鐵離子參與DA的氧化應激 腦內的鐵離子（Fe2+和Fe3+）主要分布在黑質、紋狀體和蒼白球，尤其是在黑質。在PD病人的腦內發現鐵離子的含量明顯升高，并呈現以下三方面的特點： 在黑質的鐵離子濃度異常升高，但其它腦區并 不升高； 鐵離子含量升高，但鐵蛋白的含量不變； Fe3+含量升高，但Fe2+的含量不變。 這些特點提示黑質鐵離子的升高可能與PD的發病過程有關。,31,PPT學習交流,鐵離子的促進氧化應激的作用可以通過以下幾條途徑： 如前所述，加速非酶促反

12、應的DA自身氧 化生成H2O2和O2-。 促進H2O2和O2-形成OH。 促使脂質過氧化物的分解。 鐵離子與黑色素結合沉積于黑質，催化 自由基產生。,DA神經毒的氧化應激機制示意圖,33,PPT學習交流,由上述可以得出多巴胺引起兒茶酚胺的細胞死亡主要通過以下三方面的機制： 細胞內和細胞外的多巴胺的自身氧化產生 自由基； MAO介導的多巴胺代謝產生的過氧化氫； 多巴胺對線粒體呼吸鏈的直接抑制作用。,（三）遺傳易感性 參與PD發病的遺傳調節因子： 1、-神經突觸核蛋白(-synuclein, -SN) ： 除分布在神經突觸末梢外，在神經細胞核內也有分布，因此稱為神經突觸核蛋白，可分為、和三種 。

13、有幾個PD家系的患者-SN有突變位點，主要位于染色體臂的4q21-q23，呈染色體顯性遺傳。 -SN致蛋白空間結構改變，可引起DA神經元選擇性毀損，且需要達到一定量才會發生作用。 在MPTP制備的PD模型上觀察到，黒質神經元 上-SN表達呈時間依賴性上調，并與DA神 經元退變平行。,35,PPT學習交流,2、Parkin ：parkin基因突變與早發性PD有關。Parkin主要位于神經元胞漿和突觸中，與突觸傳遞有關，功能與泛素樣蛋白裂解有關，參與泛素蛋白酶體復合物降解異常蛋白的功能，若此復合物的功能減退，則導致異常蛋白選擇性聚集在黒質多巴胺神經元，妨礙多巴胺遞質釋放和運輸，產生PD樣癥狀，同時

14、產生細胞毒性，導致細胞死亡。,36,PPT學習交流,3、細胞色素P450同工酶 ：能代謝很多內外源性物質。 亞家族CYP 2D6 可能與PD發病有關；在肝臟MPTP通過 CYP 2D6的代謝形成非毒性產物，而在腦中則經MAO-B代謝形成有毒性的產物MPP+。如果細胞色素P450酶基因和阿樸脂蛋白E同時改變時，則誘導PD的發病的可能性加大。,（四）線粒體功能缺陷 MPTP 1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+) 動物（特別是靈長類動物）產生類似PD的病理及臨床特點 機制：阻斷線粒體呼吸鏈復合物I （五）興奮性氨基酸的毒性作用 興奮性氨基酸L-谷氨酸與PD的發病有關 ，主要通過N-甲基-D天冬氨酸

15、(NMDA)起作用。,MAO-B,誘發,38,PPT學習交流,主要機制： 老齡動物神經突觸線粒體內膜上的谷氨酸載體的轉運活性明顯 谷氨酸和天冬氨酸的線粒體的內外交換發生障礙 谷氨酸在細胞內大量堆積，同時神經細胞間隙的谷氨酸不能及時地被再攝取，引起NMDA型谷氨酸受體持久性激活 （1）改變Ca2+、Na+、Cl-等離子的通透性 ，破壞細 胞的生理穩態平衡，使細胞腫脹、變性和壞死 ； （2）誘發線粒體內自由基的生成 ； （3）引起線粒體腫脹和功能異常 。 黑質變性 PD,39,PPT學習交流,（六）其他 1、炎癥反應參與PD發病過程 PD病人和長期暴露于MPTP的黑質和紋狀體有膠質增生和反應性小膠

16、質細胞；在PD的黑質中已經觀察到有膠質細胞表達的白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等炎癥反應介質。 2、細胞凋亡與PD發病 細胞凋亡參與神經細胞的發育和老化的生理和病理過程，尚無明確的證據說明凋亡是否參與PD的發病，有些現象提示凋亡可能參與PD的發 病。,40,PPT學習交流,有研究表明，MPP+ 可誘導細胞內凋亡，而細胞凋亡因子Caspase抑制可降低MPTP的神經毒性 。 3、免疫異常與PD發病 PD患者的血清對大鼠中腦DA神經元有抑制作用，并呈補體依賴性的抑制效應。PD患者中多數的病人腦脊液中含有能與黒質多巴胺神經元起免疫反應的抗體，即多巴胺神經元抗體 ；進一步的研究發現，PD患者中有78的病

17、人腦脊液中含有多巴胺神經元抗體，而對照組病人的腦脊液中僅有3的人含有多巴胺神經元抗體。,主要臨床表現,主要癥狀 靜止性震顫 肌強直 運動遲緩 姿勢步態異常 初發癥狀：震顫最多(60%70%)，步行障礙(12%)、肌強直(10%)、運動遲緩(10%),42,PPT學習交流,帕金森震顫,多數患者以震顫為首發癥狀。一側上肢遠端(手指)開始，逐漸擴展到同側下肢及對側肢體，下頜、唇、舌及頭部最后受累。 靜止性震顫，46次/秒。拇指與食指“搓丸樣”(pill-rolling)動作，安靜時出現。 多為不對稱性。 情緒激動或精神緊張時加劇，睡眠中可完全消失。,43,PPT學習交流,肌強直,初期患者感到患肢運動

18、不靈活，有僵硬或緊張的感覺，出現動作困難。 對側肢體的自主運動可誘導出肌張力的增高。 “鉛管樣強直”、“齒輪樣強直”。,44,PPT學習交流,運動遲緩,因肌張力增高、姿勢反射障礙，使起床、翻身、步行、變換方向等運動遲緩 病人有運動啟動困難和動作執行困難，是病人最常見和較特殊的表現。 早期以肢體遠端受累 對左旋多巴治療反應好,45,PPT學習交流,運動遲緩的具體表現,一般性表現： 動作啟動困難 自主動作變慢、幅度變小 重復動作易疲勞 做序列性動作困難 不能同時做多個動作 僵住,特殊表現： 解系鞋帶、扣紐扣難 “小寫癥” “面具臉” 手擺動減少 流涎 言語減少，語音低沉、單調。,46,PPT學習交

19、流,運動遲緩(bradykinesia),表情肌活動少，雙眼凝視，瞬目減少，呈面具臉(masked face)，流涎,47,PPT學習交流,手指精細動作(扣紐、系鞋帶等)困難；做序列性動作困難，不能同時做多個動作 隨意動作減少，始動困難,48,PPT學習交流,小寫癥(micrographia),49,PPT學習交流,姿勢步態異常,站-屈曲體姿 行-步態異常 轉彎-平衡障礙 早期下肢拖曳；之后小步態、啟動困難、行走時上肢擺動消失,50,PPT學習交流,屈曲體姿,51,PPT學習交流,四、PD的診斷和治療,診斷標準 1.靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢性反射障礙；四個癥狀和體征中的二個。 2.排

20、除帕金森綜合征 沒有可以引起繼發性帕金森病的病因： 如腦外傷、腦血管疾病、病毒感染、金屬中毒、一氧化碳中毒等。 3.必要時可結合左旋多巴實驗或阿樸嗎啡實驗。,52,PPT學習交流,修訂的帕金森病診斷標準： 有下列表現三項以上的可以診斷： 1. 起病：一個或多個肢體的運動緩慢、靜止性 震顫。 2. 明顯的單側分布起病形式。 3. 鉛管樣或齒輪樣強直，伴有面部、軀干或肢體的運動減少，姿勢反射異常等。 4. L-DOPA治療兩個月內反應良好（改善25%以上）。 左旋多巴可以改善臨床癥狀，降低死亡率，是治療PD的金標準,53,PPT學習交流,不支持PD診斷的癥狀和體征： 1. 下運動神經元損害。 2.

21、 失用性步態障礙。 3. 小腦癥狀、意向性震顫。 4. 凝視麻痹。 5. 明顯的癡呆伴輕度錐體外系癥狀。 6. 嚴重的自主神經功能障礙。,（二）PD的治療 1、 藥物治療 藥物治療是目前最常用的方法，主要針對增加多巴胺遞質而改善癥狀： （1）左旋多巴：是數十年來最主要的治療藥物 ； （2）單胺氧化酶B（monoamine oxidase B, MAO-B）：抑制多巴胺的代謝； （3）多巴胺受體激動藥：激活紋狀體神經元上的 D1和D2多巴胺受體，增加多巴胺含量 ； （4）乙酰膽堿抑制藥。,55,PPT學習交流,2、其他正在進行臨床試驗的新療法 （1）多巴胺能組織移植 （2）多巴胺和去甲腎上腺素的

22、微球體注入紋 狀體內，能可控地釋放多巴胺 ； （3）神經營養因子（neurotrophic factors, NTFs）的治療 A:膠質源性神經營養因子（GDNF） B:腦源性神經營養因子（BDNF）,56,PPT學習交流,GDNF和BDNF能提高多巴胺能神經元的生存能力，減少MPTP和6-羥多巴對黑質紋狀體系統的損害，改善6-羥多巴所致的旋轉癥狀。 C:堿性成纖維細胞生長因子( bFGF) 能提高多巴胺合成酶-酪氨酸羥化酶(TH)免疫活性細胞的數目及活性。 將神經營養因子注入到黑質、紋狀體或腦室內可以挽救PD患者的多巴胺能神經元，減輕黑質紋狀體系統損害產生的震顫麻痹癥狀。,57,PPT學習交

23、流,3、基因治療 PD的基因治療策略： （1）導入編碼多巴胺合成酶的基因以增加多巴 胺局部含量； （2）將神經營養因子基因引入到黑質和紋狀體 以阻止或減緩多巴胺能神經元的退變，甚 至促進損傷神經元的恢復。 基因導入的方式 ： （1）直接體內(in vivo)導入:載體 （2）間接體內(ex vivo)導入:細胞,58,PPT學習交流,3.1 基因轉移的載體，用于直接體內的表達載體,59,PPT學習交流,3.2 用于間接體內的基因修飾細胞 基因修飾細胞：將外源基因克隆到一個合適的載體并導入體外培養的自體或異體靶細胞內，這種細胞即是基因修飾細胞。 表達載體：真核表達質粒和反轉錄病毒 靶細胞：神經元

24、前體細胞、原代神經元、神經膠質細胞、成纖維細胞和成肌細胞等。,60,PPT學習交流,3.3 神經遞質替代的基因治療 將編碼合成多巴胺的酪氨酸羥化酶( tyroxine hydroxylase，TH ) 和其他與多巴胺合成相關的酶基因引入紋狀體，是目前基因治療PD的主要策略 。 直接體內酶替代基因治療 A: 將攜帶TH基因的HSV-1擴增子載體或AAV載體注射到腦內，促進多巴胺合成； B: AAV同時介導TH和GTPCH-I/ADCC基因進 入紋狀體內，增加多巴胺含量 ； C: 編碼D2受體的腺病毒載體進入大鼠紋狀體， 增加D2受體的表達。,61,PPT學習交流, 間接體內酶替代基因治療 間接體

25、內方法通常先用磷酸鈣轉染或病毒感染的方法對靶細胞進行基因修飾，再將攜帶目的基因的細胞植人腦內以達到治療目的。 移植基因修飾細胞的治療效果明顯，但轉移基因細胞的表達呈進行性下降，因此，長期表達是需要解決的問題。,62,PPT學習交流,3.4 神經營養因子的基因治療 神經營養因子的在PD中的作用： A: 能維持多巴胺能神經元的存活； B: 促進突起生長； C: 增強多巴胺神經元對多巴胺的攝取能力； D: 減輕或防止多巴胺能神經元的損傷，減輕 PD癥狀。,63,PPT學習交流, 直接體內神經營養因子基因治療 載體：Ad、AAV、HSV-1和慢病毒等病毒載體 神經營養因子：最主要的是GDNF GDNF

26、作用：防止多巴胺神經元的破壞，對黑質多巴胺能系統產生保護和修復作用，減輕PD癥狀。 間接體內神經營養因子基因治療 GDNF, BDNF, bFGF 成纖維細胞、成肌細胞、星型膠質細胞 基因修飾細胞 黑質或紋狀體 分泌神經營養因子 減輕PD癥狀,反轉錄病毒載體,64,PPT學習交流,五、用于PD研究的動物模型 （一）帕金森病動物模型的發展： 19世紀50年代，Carlson，腹腔內注射利血平后，表現出了類似人類帕金森病的癥狀。但是該模型不同個體間差別較大，而且其病理改變與人類PD大不相同。 1968，6-OHDA 80年代初期，MPTP,65,PPT學習交流,（二）利用6-羥多巴（6-OHDA）

27、制備的 大鼠PD模型 1. 6-OHDA的建模機制： (1) 黑質內的6-OHDA與DA競爭攝取位點； (2) 細胞內外的氧化反應把6-OHDA分解后產生活性氧，通過MAO誘導產生H2O2； (3) 直接引起線粒體功能障礙。,2. 6-OHDA制模的方法： 完全損傷模型 ：用成年健康SD大鼠或Wistar大鼠麻醉后，固定于立體定位儀，將6-OHDA定向注射于大鼠的內側前腦束（Medial Forebrain Bundle, MFB）或黑質。 模型成功標準：模型制備成功后，外周注射DA能受體直接激動劑（如阿普嗎啡、左旋多巴等）能誘發動物向健側旋轉，促DA釋放劑如苯丙胺等能誘發動物向損傷側旋轉。,

28、67,PPT學習交流, 部分損傷模型 ： A: 小劑量6-OHDA黑質內注射； B: 黑質致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）周圍注射，外側單點注射和內外側兩點注射； C: 紋狀體內注射。,68,PPT學習交流,3. 6-OHDA模型的行為測定與評定： 大鼠PD模型制備成功的標準：注入誘導劑后，通過旋轉測量儀計算30分鐘內大鼠旋轉的總次數，若超過平均7轉/分鐘，連續4周誘發旋轉次數穩定，表示損毀穩定，可認為模型制備成功。 完全損傷模型 ：可模擬晚期帕金森病病人的特征，主要用于黑質細胞移植，TH基因及膠質源性神經營養因子移植等研究。 6-OHDA單側損

29、毀模型 ：用于PD的發病機制及藥物療效判定、細胞移植治療、基因治療和神經保護治療等方面的研究。,69,PPT學習交流,（三）利用MPTP制作的帕金森病動物模型 1. MPTP制模的方法 . 非人靈長類動物雙側PD模型； . 非人靈長類動物偏側PD模型； . 小鼠PD模型； . 貓的PD模型。,70,PPT學習交流,2. MPTP的制模機制：MPTP 主要通過MPP+ 發揮作用 （1）抑制線粒體的呼吸功能； （2）產生氧自由基和改變Ca2+流； 使黑質神經元細胞減少。 （3）低濃度的MPP+能誘發黑質細胞發生凋 亡，而高濃度的MPP+則導致細胞死亡。,71,PPT學習交流,3. MPTP模型的行為測定與評價： . 非人靈長類雙側PD動物模型： 較少用 . 非人靈長類偏側PD動物模型：是目前建立 機制、診斷和治療等方面的研究。 . 貓PD模型： 在PD基礎和臨床藥理研究方 面具有很好的應用價值。 . 小鼠MPTP模型：主要用于檢測藥物毒性機 制等實驗，一般不進行行為測定。,72,PPT學習交流,（四）利用其它藥物和方法制作的PD動物模型： 1. 遺傳學模型：-神經突觸核蛋白基因和 Parkin基因PD動物模型。 2.免疫損傷模型：將PD患者血清免疫球蛋白 或免疫激活劑