目錄TOC\o"1-3"\h\u、26963 267481 2120332 271083 2121844 259405 28906 230137 39481 3171976 3141307 414272 42163 499127.2.1 4175347.2.2 4175047.2.3 4123648 410859 529180 56648 51164PCR 515016 57808 52697410 619134 612580 611540 63271111 630806 612326 62540 7202312 732581附錄 819374 1031640 11SC/T7103BstDNABstDNAPolymerasebp：堿基對（basepair）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyriboNucleicdNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EHP：蝦肝腸胞蟲EnterocytozoonheppenatoaeiLAMP：環介導等溫擴增（Loop-MediatedIsothermalAmplification）PCR：聚合酶鏈反應polymerasechainreactionSWP：孢子壁蛋白（sporewallTAE(Trisbaseaceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)SYBRGreenqPCRMix：含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量PCR95A70A0.45μm3A16PEG8000見附錄A0.2mol/L(Na2HPO4）見附錄AK：見附錄ATaqDNA（5U/μL）：生化試劑，-2010×PCRTaqDNA20氯化鎂（Mgcl2）溶液（25mmol/L）：生化試劑，-2010μmol/L，-20DNAMarkerSYBRGreenqPCRMix熒光PCR引物，使用濃度為10μmol/L，-20-10×thermal甜菜堿，5mol/L硫酸鎂，150mmol/LBstDNA8U/μLAA-3’（400V～600V水平電泳槽：50mL～500mL12000r/min5mL、0.2mLPCR1.5mL活體或冷凍幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦個體樣品約5mg～100mg；活體或冷凍蝦的肝胰腺5mg～100mg；活體或冰凍餌料生物樣品5mg～100mg。4提，或置于滅菌采樣容器內，加入待檢樣三倍體積的95%乙醇沒過待檢樣，-20℃保存。水樣用無菌容器采集100mL～500mL，4應將水樣置于-20℃冰柜保存待檢。取100mL水樣經0.45μm硝酸纖維素膜過濾后，取出硝酸纖維素膜并剪碎，放入裝有1.5mL的32mL樣品處理管中，震蕩20min～30min，或用超聲破碎儀破碎15min。取出上清轉移至干凈的5mL離心管中。加入等體積的16PEG8000溶液，震蕩充分混勻，調節pH至7.0，4℃靜置2h～3h，或靜置過夜。412000r/min離心5min，棄上清。加入500μL0.2mol/LNa2HPO4，振蕩412000r/min離心5min6.2DNADNA。450μL3μLK（20mg/mL），混勻，563h10min10000r/min3min，取1.5mL1min1.5mL1.5mL100μL10mol/L20）勻，-202h。10000r/min10min70210000r/min5min，小心傾去上清，沉50μL～100μLDNADNA50μL～100μLTE20℃。在0.2mLPCR管中加入10×PCR緩沖液2.5μL、25mmol/LMgcl21.5μL、dNTP0.5μL、引物F514和R514各1μL、Taq酶0.1μL、待測模板DNA1μL，最后加滅菌雙蒸水至25μL短暫離心后將PCR管置于PCR儀中，按以下程序進行擴增：95℃5min；95℃30s,，58℃30s，68℃45s，30次循環；68℃5min；4PCR在0.2mLP1PCR.5μL5mml/.5μLNTP.5μ、F4R14各1μLa酶01L1μL水25μL）CPR55i53043068℃0268℃5mi；4用1×TAE電泳緩沖液配制1.5%且含1μg/mL核酸染料的瓊脂糖凝膠。將該凝膠平板放入水平電泳槽，加樣孔朝負極，加入1×TAE電泳緩沖液至沒過膠面1mm～2mm。將6μLPCR擴增產物和2μL樣品緩沖液混勻后加入加樣孔。同時設立DNA分子量標準對照。5V/cm電泳陽性對照第一步PCR514bpPCR147bp待測樣品第一步PCR514bpPCR147bp待測樣品第一步PCR514bpPCR147bpPCR95℃30s；95℃5s，60℃30s，40Ct30SCt＞30SCt≤30S待測樣品PCR1（或者按商品化預混液說明書配制反應體PCR6340min。表1加樣量101外側上游引物100.2外側下游引物100.2內側上游引物401.6內側下游引物401.6環引物400.8環引物400.8表1環介導等溫擴增反應體系表（續加樣量101.650.8150680.321008陽性對照反應產生典型SSPCRPCRLAMPEHP附錄 70加水30mL，混勻，定容至 100mL 95加水5mL，混勻，定容至 100mL3%牛肉膏洗脫液（pH 30.0加水溶解，調節pH至9.0，定容至 1000mL高壓滅菌15min，室溫保存。16%PEG8000 160.0 17.5 100015min0.2mol/L的Na2HPO4（pH 71.6加水溶解，調節pH至9.0，定容至 1000mL高壓滅菌15min，室溫保存。1mol/LTris·HCl