Let-7i在缺血再灌注損傷中對腦血管內皮細胞間質化的調控機制探究一、引言1.1研究背景與意義缺血性腦血管疾病，如腦梗死，是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。腦缺血發(fā)生后，及時恢復血液灌注是挽救腦組織的關鍵治療策略，然而，再灌注過程往往會引發(fā)一系列復雜的病理生理反應，導致缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusioninjury，IRI），進一步加重腦組織損傷。腦血管內皮細胞作為血腦屏障的重要組成部分，在維持腦內微環(huán)境穩(wěn)定、調節(jié)腦血流以及保護神經元等方面發(fā)揮著關鍵作用。缺血再灌注損傷會對腦血管內皮細胞造成嚴重影響，導致其功能障礙。例如，會破壞腦血管內皮細胞的緊密連接結構，使得血腦屏障通透性增加，引發(fā)腦水腫，有害物質得以進入腦組織，損害神經元和神經膠質細胞。缺血再灌注還會誘導腦血管內皮細胞發(fā)生凋亡、壞死等細胞死亡形式，影響血管的正常功能和結構完整性。同時，激活炎癥反應和氧化應激，導致炎癥因子和自由基大量釋放，進一步損傷腦血管內皮細胞和周圍組織。內皮細胞間質化（Endothelialtomesenchymaltransition，EndMT）是指內皮細胞在特定條件下失去內皮細胞特性，獲得間質細胞特征的過程。在缺血再灌注損傷后的腦血管內皮細胞中，EndMT現象時有發(fā)生。發(fā)生EndMT的腦血管內皮細胞會出現形態(tài)學改變，從扁平的上皮樣形態(tài)轉變?yōu)樗笮蔚拈g質樣形態(tài)，同時細胞的生物學功能也發(fā)生改變，如遷移能力增強、增殖能力變化以及分泌功能異常。這種變化會影響血管的正常修復和再生過程，導致血管功能紊亂，進而影響腦血流的恢復和腦組織的供血供氧，在缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。Let-7i作為微小RNA（miRNA）家族的重要成員，近年來在多種生理和病理過程中的調控作用受到廣泛關注。miRNA是一類內源性的非編碼小分子RNA，長度通常在22個核苷酸左右，通過與靶基因mRNA的互補配對結合，在轉錄后水平調控基因表達。Let-7i在細胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中都發(fā)揮著重要作用。在缺血再灌注損傷的研究領域，已有研究表明Let-7i可能參與其中的調控過程。在心肌缺血再灌注損傷模型中，Let-7i的表達水平發(fā)生顯著變化，并且通過調控相關靶基因，對心肌細胞的凋亡、炎癥反應和氧化應激等過程產生影響，提示Let-7i在缺血再灌注損傷中具有潛在的保護作用。然而，目前關于Let-7i在缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化過程中的作用及機制研究還相對較少。深入研究Let-7i調節(jié)缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的機制，具有重要的理論和臨床意義。在理論方面，有助于進一步揭示缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，豐富對腦血管內皮細胞在缺血再灌注損傷后病理變化過程的認識，為理解缺血性腦血管疾病的發(fā)病機制提供新的視角和理論依據。在臨床方面，有望為缺血性腦血管疾病的治療提供新的靶點和策略。通過調控Let-7i的表達或其相關信號通路，可能能夠干預腦血管內皮細胞間質化過程，減輕缺血再灌注損傷，促進腦血管的修復和再生，改善患者的預后，具有潛在的臨床應用價值，為缺血性腦血管疾病的治療帶來新的希望。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探討Let-7i在缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化過程中的調節(jié)作用及具體分子機制，為缺血性腦血管疾病的治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體研究內容如下：細胞實驗：體外培養(yǎng)腦血管內皮細胞，構建氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）細胞模型，模擬缺血再灌注損傷。將細胞分為正常對照組、OGD/R模型組、Let-7i過表達組和Let-7i抑制組。通過轉染技術，使Let-7i過表達組細胞中Let-7i表達上調，Let-7i抑制組細胞中Let-7i表達下調。利用免疫熒光、Westernblot等技術檢測內皮細胞間質化相關標志物的表達變化，如內皮細胞標志物CD31、VE-Cadherin的表達水平降低，間質細胞標志物α-SMA、Fibronectin的表達水平升高，以此判斷EndMT的發(fā)生情況。采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，Transwell實驗檢測細胞遷移能力，探討Let-7i對缺血再灌注后腦血管內皮細胞生物學功能的影響。通過熒光定量PCR和Westernblot技術檢測Let-7i下游可能的靶基因mRNA和蛋白表達水平，利用生物信息學分析預測Let-7i的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證Let-7i與靶基因的直接靶向關系，明確Let-7i調節(jié)腦血管內皮細胞間質化的潛在分子機制。動物實驗：選用健康成年小鼠，采用線栓法建立大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型，模擬腦缺血再灌注損傷。將小鼠隨機分為假手術組、MCAO/R模型組、Let-7i激動劑組和Let-7i拮抗劑組。Let-7i激動劑組通過腦立體定位注射給予Let-7i激動劑，促進Let-7i的表達；Let-7i拮抗劑組給予Let-7i拮抗劑，抑制Let-7i的表達。在再灌注后的不同時間點，采用神經功能缺損評分評估小鼠的神經功能恢復情況，通過TTC染色檢測腦梗死體積，評價Let-7i對腦缺血再灌注損傷的影響。取小鼠腦組織，進行免疫組化、免疫熒光和Westernblot等實驗，檢測腦血管內皮細胞間質化相關標志物的表達，觀察Let-7i對體內腦血管內皮細胞間質化的影響。利用蛋白質組學、轉錄組學等技術，全面分析小鼠腦組織中基因和蛋白質表達譜的變化，篩選出與Let-7i調節(jié)腦血管內皮細胞間質化相關的信號通路和關鍵分子，進一步驗證細胞實驗中發(fā)現的分子機制，為深入理解Let-7i在缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化中的作用提供體內實驗依據。1.3研究方法與技術路線細胞培養(yǎng)：選用人腦血管內皮細胞系，在含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液，待細胞生長至對數期時進行后續(xù)實驗。氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）細胞模型構建：將培養(yǎng)的腦血管內皮細胞用無糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）洗滌后，置于無氧培養(yǎng)箱（95%N?、5%CO?）中，37℃孵育一定時間（如6小時）進行氧糖剝奪處理，模擬缺血狀態(tài)。隨后更換為正常培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱（37℃、5%CO?）中復氧復糖培養(yǎng)，模擬再灌注過程。轉染技術：針對Let-7i過表達組，采用脂質體轉染法將Let-7i模擬物（mimics）轉染至腦血管內皮細胞中，促進Let-7i的表達；對于Let-7i抑制組，轉染Let-7i抑制劑（inhibitor），抑制Let-7i的表達。按照脂質體轉染試劑說明書的操作步驟進行轉染，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，進行后續(xù)檢測。免疫熒光檢測：將細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞處理完成后，用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100通透，5%BSA封閉，分別加入內皮細胞標志物CD31、VE-Cadherin和間質細胞標志物α-SMA、Fibronectin的一抗，4℃孵育過夜。次日，加入相應的熒光二抗，室溫孵育1-2小時，DAPI染核，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析細胞標志物的表達和定位情況。Westernblot檢測：收集細胞或組織樣本，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1-2小時，分別加入目的蛋白（如CD31、VE-Cadherin、α-SMA、Fibronectin、Let-7i下游靶基因蛋白等）和內參蛋白（如GAPDH）的一抗，4℃孵育過夜。次日，加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時，ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光并分析條帶灰度值，以定量檢測蛋白表達水平。CCK-8法檢測細胞增殖活性：將細胞接種于96孔板中，每組設置多個復孔，分別在不同時間點（如24小時、48小時、72小時）加入CCK-8試劑，孵育1-4小時后，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線，評估細胞增殖活性。Transwell實驗檢測細胞遷移能力：使用Transwell小室，上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時間（如24小時）后，取出小室，擦去上室未遷移的細胞，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取多個視野計數遷移到下室的細胞數量，評估細胞遷移能力。熒光定量PCR檢測：提取細胞或組織中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，利用特異性引物進行熒光定量PCR擴增。反應體系和條件按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行設置，以GAPDH作為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因（如Let-7i、Let-7i下游靶基因mRNA等）的相對表達量。雙熒光素酶報告基因實驗：根據生物信息學預測結果，構建含有Let-7i潛在靶基因3'UTR的野生型和突變型熒光素酶報告載體。將報告載體與Let-7imimics或陰性對照共轉染至293T細胞中，培養(yǎng)48小時后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作步驟，測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算相對熒光素酶活性，驗證Let-7i與靶基因的直接靶向關系。大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型構建：選用健康成年小鼠，采用線栓法進行建模。小鼠麻醉后，分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，將尼龍線經頸外動脈插入頸內動脈，阻塞大腦中動脈起始部，缺血一定時間（如90分鐘）后，拔出尼龍線實現再灌注，假手術組小鼠只進行手術操作，不插入尼龍線。神經功能缺損評分：在再灌注后的不同時間點（如24小時、48小時、72小時），由盲法觀察者對小鼠進行神經功能缺損評分，采用Longa5分制評分法，0分表示無神經功能缺損癥狀；1分表示不能完全伸展對側前爪；2分表示向對側轉圈；3分表示向對側傾倒；4分表示不能自發(fā)行走，意識喪失。TTC染色檢測腦梗死體積：再灌注24小時后，將小鼠處死，取腦，切成2mm厚的冠狀切片，放入2%TTC溶液中，37℃避光孵育15-30分鐘，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織呈白色，用ImageJ軟件分析腦梗死體積百分比。免疫組化檢測：取小鼠腦組織，經固定、脫水、包埋后制成石蠟切片，切片脫蠟至水，抗原修復，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，5%BSA封閉，加入內皮細胞間質化相關標志物的一抗，4℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察并拍照，分析標志物的表達和定位情況。蛋白質組學分析：取小鼠腦組織樣本，進行蛋白質提取、酶解、肽段分離等處理后，采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）進行蛋白質組學分析。通過生物信息學分析，篩選出差異表達的蛋白質，進行功能富集分析和信號通路分析，尋找與Let-7i調節(jié)腦血管內皮細胞間質化相關的關鍵蛋白和信號通路。轉錄組學分析：提取小鼠腦組織中的總RNA，進行文庫構建，利用高通量測序技術進行轉錄組測序。對測序數據進行質量控制、比對和差異表達分析，篩選出差異表達的基因，進行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，挖掘與Let-7i調節(jié)腦血管內皮細胞間質化相關的基因和信號通路。本研究技術路線如圖1所示：graphTD;A[細胞實驗]-->B[細胞培養(yǎng)];B-->C[OGD/R模型構建];C-->D[分組與轉染];D-->E[檢測指標];E-->F[免疫熒光];E-->G[Westernblot];E-->H[CCK-8];E-->I[Transwell];E-->J[熒光定量PCR];E-->K[雙熒光素酶報告基因實驗];L[動物實驗]-->M[MCAO/R模型構建];M-->N[分組與干預];N-->O[神經功能缺損評分];N-->P[TTC染色];N-->Q[取材與檢測];Q-->R[免疫組化];Q-->S[蛋白質組學分析];Q-->T[轉錄組學分析];U[機制分析]-->V[生物信息學分析];V-->W[驗證實驗];圖1：研究技術路線圖首先進行細胞實驗，培養(yǎng)腦血管內皮細胞并構建OGD/R模型，分為正常對照組、OGD/R模型組、Let-7i過表達組和Let-7i抑制組，進行轉染操作后，通過免疫熒光、Westernblot等多種技術檢測細胞間質化相關指標、生物學功能以及Let-7i靶基因驗證。同時開展動物實驗，構建MCAO/R小鼠模型，分組并給予Let-7i激動劑或拮抗劑干預，進行神經功能缺損評分和TTC染色評估腦損傷情況，取腦組織進行免疫組化、蛋白質組學和轉錄組學分析。最后綜合細胞與動物實驗結果，利用生物信息學分析和驗證實驗，深入探討Let-7i調節(jié)缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的機制。二、缺血再灌注損傷與腦血管內皮細胞間質化概述2.1缺血再灌注損傷的概念與危害缺血再灌注損傷是指機體組織器官在經歷一段時間的缺血后，恢復血液灌注時，組織器官的損傷反而進一步加重的病理過程。這一現象最早在1960年被Jennings等人發(fā)現，他們在犬心肌缺血再灌注實驗中觀察到，恢復血流后心肌細胞的損傷程度比持續(xù)缺血時更為嚴重。此后，缺血再灌注損傷在多個器官系統(tǒng)中被證實，包括腦、心臟、肝臟、腎臟、腸道等。在腦缺血再灌注損傷中，腦部血管因各種原因（如血栓形成、栓塞等）導致血流中斷，腦組織出現缺血缺氧。在缺血期間，腦細胞的能量代謝發(fā)生障礙，ATP生成減少，細胞膜離子泵功能失調，導致細胞內鈉離子和鈣離子積聚，細胞水腫。同時，無氧酵解增強，乳酸堆積，引起細胞內酸中毒。當恢復血液灌注后，大量氧氣進入組織，會引發(fā)一系列復雜的病理生理反應。一方面，氧自由基大量產生，超過了機體的抗氧化防御能力，導致氧化應激損傷。氧自由基可攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質過氧化反應，破壞細胞膜的結構和功能，導致細胞損傷和死亡。另一方面，炎癥反應被激活，缺血區(qū)的小膠質細胞和星形膠質細胞活化，募集炎癥細胞聚集，釋放大量炎性介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎性介質進一步損傷腦血管內皮細胞和神經元，破壞血腦屏障，加重腦水腫，導致腦功能障礙。臨床上，腦缺血再灌注損傷患者可出現感覺、意識、運動功能障礙，嚴重時甚至導致死亡。心臟也是缺血再灌注損傷的常見受累器官。在心肌缺血再灌注過程中，心肌細胞同樣面臨能量代謝紊亂、氧自由基損傷和炎癥反應等問題。再灌注時，心肌細胞之間的動作電位恢復時限不一致，容易引發(fā)心律失常，如室性心動過速、心室顫動等，嚴重時可導致猝死。此外，再灌注損傷還會導致心肌收縮功能障礙，影響心臟的泵血功能，引發(fā)心力衰竭。研究表明，急性心肌梗死患者接受再灌注治療后，約有30%-50%的患者會發(fā)生不同程度的心肌缺血再灌注損傷，嚴重影響患者的預后。除了腦和心臟，其他器官的缺血再灌注損傷也會對機體造成嚴重危害。例如，肝臟缺血再灌注損傷可導致肝功能異常，出現轉氨酶升高、膽紅素代謝紊亂等，影響肝臟的解毒、合成和代謝功能；腎臟缺血再灌注損傷可引起急性腎衰竭，導致腎小球濾過率下降，出現少尿、無尿等癥狀，嚴重時需要透析治療；腸道缺血再灌注損傷不僅會影響腸道的消化和吸收功能，還可能引發(fā)全身炎癥反應綜合征，導致多器官功能障礙綜合征，危及生命。缺血再灌注損傷是一種嚴重的病理過程，可對多個器官系統(tǒng)造成損害，嚴重威脅患者的生命健康和生活質量。深入研究缺血再灌注損傷的機制，尋找有效的防治措施，具有重要的臨床意義。2.2腦血管內皮細胞間質化的過程與機制腦血管內皮細胞間質化是一個復雜且有序的生物學過程，涉及細胞形態(tài)、分子標志物以及信號通路等多方面的變化。在形態(tài)學方面，正常的腦血管內皮細胞呈扁平狀，緊密排列成單層，形成連續(xù)的血管內皮屏障。當受到缺血再灌注等刺激時，細胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變。細胞開始失去原本的扁平形態(tài)，變得細長，呈現出梭形的間質樣形態(tài)。這種形態(tài)變化伴隨著細胞骨架的重構，微絲、微管等細胞骨架成分的分布和組裝發(fā)生改變，為細胞的遷移和變形提供了基礎。例如，在體外培養(yǎng)的腦血管內皮細胞經歷氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）處理后，可明顯觀察到細胞從典型的鵝卵石樣形態(tài)轉變?yōu)樗笮危毎g的連接變得松散。分子標志物的改變是腦血管內皮細胞間質化的重要特征。內皮細胞標志物如CD31和VE-Cadherin在間質化過程中表達顯著下調。CD31，也稱為血小板內皮細胞黏附分子-1（PECAM-1），主要分布于內皮細胞表面，在維持內皮細胞間的連接和信號傳導中發(fā)揮重要作用。VE-Cadherin，即血管內皮鈣黏蛋白，是構成內皮細胞緊密連接的關鍵分子，對維持血腦屏障的完整性至關重要。當腦血管內皮細胞發(fā)生間質化時，CD31和VE-Cadherin的表達水平降低，導致內皮細胞間的連接減弱，血腦屏障通透性增加。與之相反，間質細胞標志物如α-SMA（α-平滑肌肌動蛋白）和Fibronectin（纖連蛋白）的表達則明顯上調。α-SMA是平滑肌細胞的標志性蛋白，其表達增加表明細胞獲得了平滑肌樣的收縮特性；Fibronectin是細胞外基質的重要組成部分，參與細胞的黏附、遷移和組織修復等過程。在缺血再灌注損傷后的腦血管內皮細胞中，α-SMA和Fibronectin的表達升高，提示細胞向間質細胞表型轉化。腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生受到多種信號通路的調控，其中轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路和Notch信號通路起著關鍵作用。TGF-β信號通路是誘導EndMT的經典通路之一。TGF-β是一類多功能的細胞因子，在體內廣泛表達。當TGF-β與其受體TβRII結合后，TβRII磷酸化并招募TβRI，形成異源二聚體復合物。TβRI被激活后，進一步磷酸化下游的Smad2和Smad3蛋白。磷酸化的Smad2/3與Smad4結合形成復合物，轉移至細胞核內，與特定的DNA序列結合，調節(jié)相關基因的表達，從而誘導EndMT的發(fā)生。在缺血再灌注后的腦血管內皮細胞中，TGF-β的表達水平升高，激活TGF-β信號通路，促進內皮細胞間質化相關基因的轉錄，導致內皮細胞標志物的下調和間質細胞標志物的上調。此外，TGF-β還可以通過激活非Smad信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等，參與EndMT的調控。這些非Smad信號通路與Smad信號通路相互作用，共同調節(jié)腦血管內皮細胞的間質化過程。Notch信號通路在細胞的分化、增殖和命運決定中發(fā)揮重要作用，也參與了腦血管內皮細胞間質化的調控。Notch家族由4個跨膜受體（Notch1-4）和5個配體（Delta-like1、3、4和Jagged1、2）組成。當Notch受體與配體結合后，受體被γ-分泌酶切割，釋放出Notch胞內結構域（NICD）。NICD轉移到細胞核內，與轉錄因子RBPJK/CBF1/SU（H）結合，激活下游靶基因如Hes和Hey等的轉錄。在腦血管內皮細胞間質化過程中，Notch信號通路被激活，促進內皮細胞向間質細胞的轉化。研究表明，在缺血再灌注損傷后的腦組織中，Notch信號通路的相關分子表達上調，抑制Notch信號通路可以減少腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生。Notch信號通路與TGF-β信號通路之間存在相互作用，兩者協(xié)同調節(jié)腦血管內皮細胞間質化。TGF-β可以上調Notch配體的表達，增強Notch信號通路的活性；而Notch信號通路也可以調節(jié)TGF-β信號通路中相關分子的表達，影響TGF-β信號的傳導。除了TGF-β和Notch信號通路外，其他信號通路如Wnt/β-catenin信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等也參與了腦血管內皮細胞間質化的調控。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)維持中起重要作用。在缺血再灌注損傷條件下，Wnt信號通路被激活，β-catenin進入細胞核，與轉錄因子結合，調節(jié)相關基因的表達，促進腦血管內皮細胞間質化。HIF-1是細胞對缺氧環(huán)境的重要應答調節(jié)因子。在腦缺血再灌注過程中，缺氧誘導HIF-1的表達上調，HIF-1通過調節(jié)其下游靶基因的表達，如血管內皮生長因子（VEGF）等，參與腦血管內皮細胞間質化的調控。這些信號通路之間相互交織，形成復雜的調控網絡，共同調節(jié)缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生和發(fā)展。2.3兩者之間的關聯(lián)及研究現狀缺血再灌注與腦血管內皮細胞間質化之間存在著緊密的聯(lián)系，缺血再灌注是誘導腦血管內皮細胞間質化的重要因素之一。當腦組織發(fā)生缺血再灌注損傷時，多種病理生理變化共同作用，促使腦血管內皮細胞發(fā)生間質化。缺血再灌注過程中產生的大量氧自由基是誘導腦血管內皮細胞間質化的關鍵因素之一。氧自由基具有極強的氧化活性，可攻擊細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，導致細胞結構和功能受損。在腦血管內皮細胞中，氧自由基可使細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化反應，破壞細胞膜的完整性和流動性，影響細胞的正常功能。同時，氧自由基還可激活細胞內的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，進而誘導內皮細胞間質化相關基因的表達，促使內皮細胞向間質細胞轉化。研究表明，在氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）細胞模型中，給予抗氧化劑可以減少氧自由基的產生，抑制腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生，提示氧自由基在缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化中起重要作用。炎癥反應在缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化中也發(fā)揮著重要作用。缺血再灌注損傷會引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致多種炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞等聚集在缺血腦組織中。這些炎癥細胞釋放大量的炎性介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。TNF-α和IL-1β等炎性介質可以激活腦血管內皮細胞表面的受體，通過細胞內信號轉導途徑，誘導內皮細胞間質化。TNF-α可以上調轉化生長因子-β（TGF-β）的表達，增強TGF-β信號通路的活性，從而促進腦血管內皮細胞間質化。炎癥反應還會導致血管內皮細胞的損傷和功能障礙，破壞血腦屏障的完整性，進一步加重腦組織的損傷，為腦血管內皮細胞間質化提供了有利的微環(huán)境。缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路在缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化中也扮演著重要角色。在缺血再灌注過程中，腦組織缺氧會導致HIF-1的表達上調。HIF-1是一種轉錄因子，可調節(jié)一系列下游靶基因的表達，以適應缺氧環(huán)境。在腦血管內皮細胞中，HIF-1可以上調血管內皮生長因子（VEGF）的表達，VEGF具有促進血管生成和調節(jié)血管通透性的作用。然而，在缺血再灌注損傷的情況下，VEGF的過度表達可能會導致腦血管內皮細胞間質化。VEGF可以激活Notch信號通路，促進內皮細胞向間質細胞的轉化。HIF-1還可以直接調節(jié)內皮細胞間質化相關基因的表達，如通過與TGF-β信號通路相互作用，增強TGF-β對內皮細胞間質化的誘導作用。目前，關于缺血再灌注與腦血管內皮細胞間質化關系的研究取得了一定的進展。在細胞實驗方面，通過建立OGD/R細胞模型，深入研究了缺血再灌注損傷對腦血管內皮細胞間質化的影響及相關分子機制。研究發(fā)現，OGD/R處理后，腦血管內皮細胞中內皮細胞標志物如CD31、VE-Cadherin的表達顯著降低，而間質細胞標志物如α-SMA、Fibronectin的表達明顯升高，表明發(fā)生了內皮細胞間質化。同時，揭示了TGF-β、Notch等信號通路在這一過程中的關鍵調控作用。在動物實驗方面，利用大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）動物模型，觀察到缺血再灌注損傷后的腦組織中腦血管內皮細胞發(fā)生間質化，并且與神經功能缺損和腦梗死體積密切相關。研究還發(fā)現，通過干預相關信號通路或給予藥物治療，可以抑制腦血管內皮細胞間質化，減輕腦缺血再灌注損傷。然而，當前研究仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。雖然已經明確了多種信號通路參與缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化，但這些信號通路之間的相互作用和調控網絡尚未完全闡明。不同信號通路之間可能存在復雜的交叉對話和協(xié)同作用，深入研究這些相互關系，對于全面理解腦血管內皮細胞間質化的機制至關重要。目前對于缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的動態(tài)變化過程研究還不夠深入。間質化的發(fā)生和發(fā)展是一個動態(tài)的過程，在不同時間點可能涉及不同的分子機制和信號通路。進一步研究腦血管內皮細胞間質化的動態(tài)變化規(guī)律，有助于更準確地把握其在缺血性腦血管疾病中的作用時機和關鍵節(jié)點，為治療提供更精準的時間窗。此外，現有的研究大多集中在細胞和動物水平，將研究成果轉化為臨床治療策略仍面臨諸多困難。如何將基礎研究中的發(fā)現應用于臨床實踐，開發(fā)出安全有效的治療方法，仍是亟待解決的問題。三、Let-7i的生物學特性及功能研究3.1Let-7i的結構與表達特點Let-7i屬于高度保守的Let-7miRNA家族成員，其成熟序列長度約為22個核苷酸。Let-7i基因在人類基因組中定位于染色體22q13.1，其前體（pre-Let-7i）具有典型的發(fā)夾狀二級結構，由大約70-80個核苷酸組成。這種發(fā)夾結構對于Let-7i的加工和成熟至關重要，在細胞內，pre-Let-7i首先由Drosha酶切割，從細胞核轉運至細胞質，然后在Dicer酶的作用下，進一步切割形成成熟的Let-7i雙鏈RNA。隨后，雙鏈中的一條鏈被降解，另一條鏈則與AGO蛋白等結合形成RNA誘導沉默復合體（RISC），從而發(fā)揮其對靶基因的調控作用。Let-7i在不同組織和細胞中呈現出特異性的表達分布。在正常生理狀態(tài)下，Let-7i在多種組織中均有表達，但表達水平存在差異。在腦組織中，Let-7i在神經元、神經膠質細胞以及腦血管內皮細胞等多種細胞類型中均有表達。研究表明，在發(fā)育早期的腦組織中，Let-7i的表達水平相對較低，隨著大腦的發(fā)育和成熟，其表達逐漸升高。在成年腦組織中，Let-7i在海馬、皮質等區(qū)域的表達較為豐富，這些區(qū)域與學習、記憶和認知功能密切相關，提示Let-7i可能在神經系統(tǒng)的正常生理功能維持中發(fā)揮作用。在心血管系統(tǒng)中，Let-7i在心肌細胞和血管內皮細胞中也有表達。在心肌組織中，Let-7i參與心肌細胞的增殖、分化和凋亡等過程的調控。在血管內皮細胞中，Let-7i的表達對于維持血管內皮細胞的正常功能和血管穩(wěn)態(tài)具有重要意義。此外，在肝臟、腎臟、肺等其他組織中，Let-7i也有不同程度的表達，參與調節(jié)細胞的生長、代謝和分化等生物學過程。Let-7i的表達受到多種因素的調控。轉錄因子在Let-7i的表達調控中發(fā)揮重要作用。例如，NF-κB（核因子-κB）是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應和細胞應激等過程中被激活。研究發(fā)現，在炎癥刺激下，NF-κB可以結合到Let-7i基因的啟動子區(qū)域，抑制Let-7i的轉錄，從而影響其表達水平。在脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型中，NF-κB的活性增強，導致Let-7i的表達顯著降低。相反，一些轉錄激活因子如ETS1（E26transformation-specific1）等則可以促進Let-7i的轉錄，上調其表達。ETS1通過與Let-7i基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，增強RNA聚合酶與啟動子的結合能力，從而促進Let-7i的轉錄。表觀遺傳修飾也是調控Let-7i表達的重要機制。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾方式，在Let-7i基因的啟動子區(qū)域存在多個CpG島。當這些CpG島發(fā)生高甲基化時，會抑制轉錄因子與啟動子的結合，從而導致Let-7i的表達下調。在腫瘤細胞中，常常觀察到Let-7i基因啟動子區(qū)域的高甲基化，使得Let-7i的表達降低，進而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉移等生物學行為。組蛋白修飾如甲基化、乙酰化等也參與Let-7i表達的調控。組蛋白H3K4的甲基化與基因的激活相關，而H3K27的甲基化則與基因的沉默相關。研究表明，在某些生理和病理條件下，Let-7i基因所在區(qū)域的組蛋白修飾狀態(tài)會發(fā)生改變，從而影響Let-7i的表達。在胚胎發(fā)育過程中，隨著細胞的分化，Let-7i基因區(qū)域的組蛋白修飾發(fā)生動態(tài)變化，調控Let-7i的表達，以適應細胞分化和組織發(fā)育的需要。此外，一些非編碼RNA如長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）也可以通過競爭性內源RNA（ceRNA）機制調控Let-7i的表達。lncRNA和circRNA可以通過與Let-7i結合，形成ceRNA網絡，從而影響Let-7i對其靶基因的調控作用。例如，研究發(fā)現某些lncRNA可以通過與Let-7i競爭性結合，解除Let-7i對其靶基因的抑制作用，從而調節(jié)相關基因的表達和細胞的生物學功能。circRNA也具有類似的作用，通過吸附Let-7i，參與細胞內的基因表達調控網絡。3.2Let-7i在細胞生理病理過程中的作用Let-7i在細胞的生理過程中發(fā)揮著廣泛而重要的調節(jié)作用，對細胞的增殖、凋亡和分化等關鍵生物學過程有著顯著影響。在細胞增殖方面，Let-7i的作用表現出細胞類型和環(huán)境依賴性。在某些細胞中，Let-7i可抑制細胞增殖。研究表明，在肝癌細胞系中，上調Let-7i的表達能夠顯著抑制細胞的增殖能力。進一步研究發(fā)現，Let-7i通過直接靶向作用于細胞周期相關蛋白基因，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，抑制其表達，從而使細胞周期阻滯在G1期，阻礙細胞從G1期向S期的轉變，進而抑制肝癌細胞的增殖。在乳腺癌細胞中，Let-7i也被證實可以通過調控Ras-Raf-MEK-ERK信號通路來抑制細胞增殖。Ras是該信號通路的上游關鍵分子，Let-7i能夠直接結合Ras基因的mRNA，抑制其翻譯過程，使Ras蛋白表達水平降低，進而阻斷Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的激活，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。然而，在另一些細胞中，Let-7i卻具有促進增殖的作用。在口腔鱗癌細胞系SCC25中，降低Let-7i的表達會導致細胞增殖能力明顯降低，而升高Let-7i的表達則能促進細胞增殖。這表明Let-7i在不同類型細胞中的增殖調控作用存在差異，其具體機制可能與不同細胞中Let-7i的靶基因譜以及細胞內的信號網絡有關。細胞凋亡是維持細胞穩(wěn)態(tài)和組織正常發(fā)育的重要生理過程，Let-7i在其中也扮演著關鍵角色。在多種細胞模型中，Let-7i被發(fā)現可以誘導細胞凋亡。在丙泊酚誘導上皮性卵巢癌細胞凋亡的研究中，發(fā)現丙泊酚能夠上調Let-7i的表達，進而促進細胞凋亡。機制研究表明，Let-7i通過靶向作用于抗凋亡蛋白Bcl-2，降低其表達水平，使細胞內促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡向促凋亡方向傾斜，從而誘導上皮性卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。在神經細胞中，Let-7i也參與了氧化應激誘導的細胞凋亡過程。當神經細胞受到氧化應激損傷時，Let-7i的表達上調，通過抑制其靶基因如髓細胞白血病序列1（Mcl-1）等抗凋亡基因的表達，促進神經細胞凋亡。Mcl-1是Bcl-2家族的重要成員，在維持神經細胞存活中起重要作用，Let-7i通過抑制Mcl-1的表達，削弱了神經細胞的抗凋亡能力，導致細胞凋亡增加。細胞分化是細胞從一種類型轉變?yōu)榱硪环N類型的過程，Let-7i對細胞分化也具有重要的調控作用。在胚胎干細胞分化過程中，Let-7i的表達水平呈現動態(tài)變化。隨著胚胎干細胞向神經干細胞分化，Let-7i的表達逐漸升高。研究發(fā)現，Let-7i可以通過抑制多能性相關基因如Oct4、Sox2等的表達，促進胚胎干細胞向神經干細胞的分化。Oct4和Sox2是維持胚胎干細胞多能性的關鍵轉錄因子，Let-7i通過與它們的mRNA結合，抑制其翻譯過程，使Oct4和Sox2蛋白表達降低，從而推動胚胎干細胞向神經干細胞的分化進程。在脂肪細胞分化過程中，Let-7i同樣發(fā)揮著重要作用。Let-7i可以通過靶向作用于脂肪生成相關基因如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等，調節(jié)脂肪細胞的分化。PPARγ是脂肪細胞分化的關鍵調控因子，Let-7i抑制PPARγ的表達，從而抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化。在病理狀態(tài)下，Let-7i在炎癥和腫瘤等疾病過程中發(fā)揮著重要作用。炎癥是機體對各種損傷和病原體入侵的防御反應，但過度或持續(xù)的炎癥反應會導致組織損傷和疾病的發(fā)生。Let-7i在炎癥過程中扮演著重要的調節(jié)角色。在脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型中，Let-7i的表達明顯降低。進一步研究發(fā)現，Let-7i可以通過靶向作用于炎癥相關信號通路中的關鍵分子，如核因子-κB（NF-κB）信號通路中的關鍵蛋白，抑制炎癥反應。NF-κB是炎癥信號通路的關鍵轉錄因子，在LPS刺激下，NF-κB被激活并轉位進入細胞核，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄，導致炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等的大量釋放。Let-7i通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的產生，從而發(fā)揮抗炎作用。在動脈粥樣硬化的炎癥過程中，Let-7i也參與其中的調控。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，Let-7i在動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平與炎癥程度密切相關。研究表明，Let-7i可以通過調節(jié)巨噬細胞的功能，抑制其炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。巨噬細胞是動脈粥樣硬化斑塊中的主要炎癥細胞，Let-7i通過靶向作用于巨噬細胞中的炎癥相關基因和信號通路，調節(jié)巨噬細胞的極化和炎癥反應，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。腫瘤是嚴重威脅人類健康的重大疾病，Let-7i在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其作用表現為抑癌或促癌，取決于腫瘤的類型和微環(huán)境。在大多數腫瘤中，Let-7i被認為是一種抑癌基因。在肺癌中，Let-7i的表達水平明顯低于正常肺組織，且Let-7i的低表達與肺癌的不良預后相關。研究發(fā)現，Let-7i可以通過靶向作用于多個癌基因，如KRAS、HMGA2等，抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。KRAS是一種重要的癌基因，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，Let-7i通過與KRASmRNA的3'UTR結合，抑制其翻譯過程，降低KRAS蛋白表達，從而抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。在結直腸癌中，Let-7i同樣發(fā)揮著抑癌作用。Let-7i可以通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移。Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中異常激活，Let-7i通過靶向作用于該信號通路中的關鍵分子，如β-catenin等，抑制其表達和核轉位，從而阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活，抑制結直腸癌細胞的生長和轉移。然而，在某些腫瘤中，Let-7i卻表現出促癌作用。在鼻咽癌中，Let-7i-5p的過表達與鼻咽癌的晚期、復發(fā)、轉移和不良臨床結果相關。研究表明，Let-7i-5p可以通過靶向作用于自噬相關基因ATG10和ATG16L1，抑制自噬，從而促進鼻咽癌的惡性表型。自噬是一種細胞內的自我降解過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，Let-7i-5p通過抑制自噬，增強了鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進了腫瘤的發(fā)展。3.3Let-7i與腦血管疾病的相關性研究在腦血管疾病領域，Let-7i的研究逐漸成為熱點，其與多種腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷及預后密切相關。在缺血性腦血管疾病方面，研究發(fā)現Let-7i的表達水平在缺血性腦卒中患者的血清和腦組織中呈現出顯著變化。一項針對急性腦梗死患者的研究表明，與健康對照組相比，患者血清中Let-7i的表達水平明顯降低。且這種降低程度與腦梗死的嚴重程度密切相關，梗死面積越大、神經功能缺損越嚴重，Let-7i的表達下降越明顯。進一步的動物實驗也驗證了這一結果，在大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型中，缺血腦組織中Let-7i的表達顯著下調。這種表達變化提示Let-7i可能參與了缺血性腦血管疾病的病理過程。研究人員推測，Let-7i的低表達可能通過影響其下游靶基因的表達，導致腦血管內皮細胞功能障礙、炎癥反應激活以及神經細胞凋亡等，進而加重缺血性腦損傷。在腦缺血再灌注損傷模型中，Let-7i的表達同樣發(fā)生改變。氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）處理后的腦血管內皮細胞中，Let-7i的表達明顯降低。恢復氧糖供應后，細胞內的氧化應激和炎癥反應增強，可能抑制了Let-7i的表達。而Let-7i表達的降低又進一步促進了腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生，加重了血腦屏障的損傷和腦組織的炎癥反應。這表明Let-7i在腦缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著重要的保護作用，其表達的下調可能是缺血再灌注損傷加重的一個重要因素。在出血性腦血管疾病中，Let-7i的表達也呈現出特定的變化規(guī)律。顱內動脈瘤是一種常見的出血性腦血管疾病，研究發(fā)現，在顱內動脈瘤患者的血清和瘤壁組織中，Let-7i的表達水平顯著升高。對顱內動脈瘤破裂患者的血清進行檢測，發(fā)現破裂組患者血清中Let-7i的表達明顯高于未破裂組。這提示Let-7i可能參與了顱內動脈瘤的發(fā)生發(fā)展和破裂過程。進一步研究表明，Let-7i可能通過調控細胞外基質代謝相關基因的表達，影響動脈瘤壁的穩(wěn)定性。Let-7i可以靶向作用于基質金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，如MMP-2和MMP-9等，抑制其表達，從而減少細胞外基質的降解，維持動脈瘤壁的結構完整性。當Let-7i表達異常升高時，可能會打破這種平衡，導致動脈瘤壁的脆弱性增加，容易發(fā)生破裂出血。在腦出血患者中，血清Let-7i的表達水平也與病情嚴重程度和預后相關。一項研究對腦出血患者進行隨訪觀察，發(fā)現血清Let-7i表達水平較高的患者，其神經功能恢復較差，死亡率也相對較高。這表明Let-7i可能作為一個潛在的生物標志物，用于評估腦出血患者的病情嚴重程度和預后。從診斷和預后的角度來看，Let-7i具有潛在的應用價值。由于其在腦血管疾病患者體內的表達變化具有一定的特異性，可作為一種新型的生物標志物用于疾病的早期診斷。通過檢測血清或腦脊液中Let-7i的表達水平，結合臨床癥狀和影像學檢查，有望提高腦血管疾病的早期診斷準確率。對于缺血性腦卒中患者，早期檢測血清Let-7i的表達變化，有助于及時發(fā)現病情，為早期治療提供依據。Let-7i的表達水平還與腦血管疾病患者的預后密切相關。在缺血性腦卒中和出血性腦血管疾病患者中，低表達或高表達的Let-7i分別與不良預后相關。因此，監(jiān)測Let-7i的表達水平可以幫助醫(yī)生評估患者的預后情況，制定個性化的治療方案。對于Let-7i表達異常的患者，可以采取針對性的治療措施，如通過調節(jié)Let-7i的表達或干預其下游信號通路，來改善患者的預后。四、實驗材料與方法4.1實驗材料細胞系：人腦血管內皮細胞系（HBMEC），購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細胞系具有典型的腦血管內皮細胞形態(tài)和生物學特性，可用于研究腦血管內皮細胞的功能和病理變化。實驗動物：SPF級健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購自南京模式動物研究所。動物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由進食和飲水，適應環(huán)境1周后進行實驗。小鼠作為常用的實驗動物，其遺傳背景清晰，生理特征與人類有一定相似性，適合用于建立大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型，以研究腦缺血再灌注損傷。試劑與抗體：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗購自Gibco公司，用于細胞的培養(yǎng)，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質和維持無菌環(huán)境；無糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）購自Sigma公司，用于氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）細胞模型構建時模擬缺血狀態(tài)；Let-7imimics、Let-7iinhibitor及其陰性對照購自RiboBio公司，用于轉染細胞，調節(jié)細胞內Let-7i的表達水平；脂質體轉染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司，輔助完成轉染操作；CCK-8試劑購自Dojindo公司，用于檢測細胞增殖活性；Transwell小室購自Corning公司，用于檢測細胞遷移能力；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，用于提取細胞或組織中的RNA，并進行逆轉錄和熒光定量PCR檢測基因表達水平；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，用于驗證Let-7i與靶基因的直接靶向關系；兔抗人CD31、VE-Cadherin、α-SMA、Fibronectin多克隆抗體以及相應的HRP標記的山羊抗兔二抗購自Abcam公司，用于免疫熒光和Westernblot實驗檢測內皮細胞間質化相關標志物的表達；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自Proteintech公司，作為內參抗體用于Westernblot實驗，以校正目的蛋白的表達量；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，用于提取細胞或組織中的總蛋白并測定蛋白濃度；Trizol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細胞或組織中的總RNA；其他常規(guī)化學試劑均為國產分析純。儀器設備：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），提供穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)環(huán)境，維持細胞生長所需的溫度、濕度和CO?濃度；倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；超凈工作臺（蘇凈集團），保證實驗操作在無菌環(huán)境下進行；低溫高速離心機（Eppendorf），用于細胞和組織樣本的離心處理；酶標儀（Bio-Rad），用于CCK-8實驗中檢測細胞增殖活性；熒光顯微鏡（Nikon），用于免疫熒光實驗中觀察細胞標志物的表達和定位；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于Westernblot實驗中檢測蛋白條帶；實時熒光定量PCR儀（ABI），用于熒光定量PCR實驗，精確檢測基因表達水平；腦立體定位儀（Stoelting），在動物實驗中用于準確地進行腦立體定位注射；手術器械（瑞沃德），用于建立大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型；TTC染色試劑盒及相關染色設備，用于檢測腦梗死體積；液相色譜-質譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS，ThermoFisherScientific），用于蛋白質組學分析，鑒定和定量蛋白質；高通量測序儀（Illumina），用于轉錄組學分析，獲取基因表達譜信息。4.2實驗方法4.2.1細胞實驗細胞培養(yǎng)與分組：將人腦血管內皮細胞系（HBMEC）復蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數期，進行細胞傳代。傳代時，先用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使其均勻分散，按1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗分組如下：正常對照組，細胞在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；缺血再灌注模型組（OGD/R組），進行氧糖剝奪/復氧復糖處理；Let-7i過表達組，轉染Let-7imimics后進行OGD/R處理；Let-7i抑制組，轉染Let-7iinhibitor后進行OGD/R處理。每組設置多個復孔，以確保實驗結果的準確性。缺血再灌注模型建立：當細胞融合度達到70%-80%時，進行氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）處理以建立缺血再灌注模型。具體操作如下：將細胞用無糖Earle's平衡鹽溶液（EBSS）洗滌3次，去除培養(yǎng)基中的葡萄糖和血清，然后加入無糖EBSS，置于無氧培養(yǎng)箱（95%N?、5%CO?）中，37℃孵育6小時，進行氧糖剝奪處理，模擬缺血狀態(tài)。氧糖剝奪結束后，將細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，去除無糖EBSS，然后加入正常培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱（37℃、5%CO?）中復氧復糖培養(yǎng)，模擬再灌注過程。轉染Let-7i模擬物或抑制劑：按照Lipofectamine3000脂質體轉染試劑說明書進行操作。在轉染前1天，將細胞接種于24孔板中，每孔接種5×10?個細胞，使細胞在轉染時融合度達到50%-60%。轉染時，分別將Let-7imimics、Let-7iinhibitor及其陰性對照與Lipofectamine3000脂質體混合，室溫孵育5分鐘，形成轉染復合物。然后將轉染復合物加入到含有細胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染6小時后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在轉染后24小時和48小時進行后續(xù)檢測。4.2.2動物實驗動物模型構建：選用SPF級健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，采用線栓法制備大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型。小鼠術前禁食12小時，自由飲水。以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥位固定于腦立體定位儀上。在頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）。用絲線結扎CCA近心端和ECA近分叉部，在CCA上剪一小口，將預先處理好的尼龍線（直徑0.26mm，頭端光滑鈍圓）經CCA插入ICA，緩慢推進約18-20mm，直至遇到輕微阻力，此時尼龍線前端已阻塞大腦中動脈起始部，實現腦缺血。缺血90分鐘后，輕輕拔出尼龍線，恢復大腦中動脈血流，實現再灌注。假手術組小鼠只進行手術操作，分離血管但不插入尼龍線。動物分組與干預：將小鼠隨機分為4組，每組10只：假手術組，僅進行手術暴露血管，不進行缺血再灌注處理；MCAO/R模型組，進行MCAO/R手術；Let-7i激動劑組，在MCAO/R手術前30分鐘，通過腦立體定位注射給予Let-7i激動劑（10nmol/L，5μl），促進Let-7i的表達；Let-7i拮抗劑組，在MCAO/R手術前30分鐘，腦立體定位注射給予Let-7i拮抗劑（10nmol/L，5μl），抑制Let-7i的表達。取材方法：在再灌注24小時后，將小鼠用過量10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死。迅速取出腦組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化和免疫熒光檢測；另一部分置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于Westernblot和蛋白質組學分析。在取材過程中，要注意保持腦組織的完整性，避免組織損傷和污染。4.2.3檢測指標與方法細胞間質化標志物檢測：采用免疫熒光和Westernblot技術檢測內皮細胞間質化標志物的表達。免疫熒光檢測時，將細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞處理完成后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%TritonX-100通透10分鐘，5%BSA封閉1小時。分別加入兔抗人CD31、VE-Cadherin、α-SMA、Fibronectin多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，加入相應的AlexaFluor標記的山羊抗兔二抗（1:500稀釋），室溫孵育1小時，DAPI染核5分鐘，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析細胞標志物的表達和定位情況。Westernblot檢測時，收集細胞或組織樣本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進行SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時，分別加入兔抗人CD31、VE-Cadherin、α-SMA、Fibronectin多克隆抗體以及小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，加入相應的HRP標記的山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時，ECL化學發(fā)光試劑顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光并分析條帶灰度值，以定量檢測蛋白表達水平。相關信號通路蛋白及基因表達檢測：通過Westernblot和qRT-PCR技術檢測相關信號通路蛋白及基因的表達。Westernblot檢測方法同上，選用相應的信號通路蛋白抗體，如p-Smad2/3、Smad2/3、NICD、Hes1等，以檢測TGF-β和Notch信號通路的激活情況。qRT-PCR檢測時，采用Trizol試劑提取細胞或組織中的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行熒光定量PCR擴增。反應體系和條件按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行設置，以GAPDH作為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。引物序列如下：|基因|上游引物（5'-3'）|下游引物（5'-3'）||||||GAPDH|CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA|TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC||CD31|AGAGCCAGCAGCAGAGACAT|TGTGCTTGGAGTCTTGGTTG||VE-Cadherin|GCCAGTACGACCTGCTCTTC|CCACAGCAGTTCAGGGAGTA||α-SMA|ACCCAGATCATGTTTGAGAC|GAGAGTGTGACGGTGGTCAT||Fibronectin|CCAAGAAGCCAACAAGAAGG|TGTGCTGTTGGGTAGAGTGG||Let-7i|CGGCGGTAGTAGTTTGGTATTTT|-||U6|CTCGCTTCGGCAGCACA|AACCCTTCACGAATTTGCGT||p-Smad2/3|AGCAGCTGAGAGACAGAGGA|GGCAGCTGGTAGAGAAGAGC||Smad2/3|CCGCTGATGTTCTGCTCTAC|GCCATCACTCTTGGACCTTC||NICD|AGTGTGGTGGCTGTGTTGAC|TGGACGTAGACCTGGAGTGA||Hes1|AGCAGCAGAAGACGACAGAA|GGCTTCTGCTGGTCTTCTTC|五、實驗結果與分析5.1Let-7i對缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的影響通過一系列實驗，深入探究了Let-7i對缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的影響，以下是詳細的實驗結果與分析。5.1.1細胞形態(tài)學觀察在正常培養(yǎng)條件下，人腦血管內皮細胞（HBMEC）呈現典型的鵝卵石樣扁平形態(tài)，細胞邊界清晰，緊密排列成單層（圖2A）。當細胞經歷氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）處理后，即缺血再灌注模型組，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。細胞變得細長，呈現出梭形的間質樣形態(tài)，細胞間連接松散，部分細胞出現回縮和脫落現象（圖2B），這表明缺血再灌注誘導了腦血管內皮細胞發(fā)生間質化。在Let-7i過表達組中，轉染Let-7imimics后進行OGD/R處理，細胞形態(tài)與OGD/R模型組相比，有明顯的改善。大部分細胞仍能保持相對扁平的形態(tài)，細胞間連接較為緊密，梭形細胞的數量明顯減少（圖2C），提示Let-7i過表達能夠抑制缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化過程。相反，在Let-7i抑制組中，轉染Let-7iinhibitor后進行OGD/R處理，細胞形態(tài)變化更為顯著。細胞呈現出更為典型的梭形間質樣形態(tài)，細胞間連接進一步破壞，細胞脫落現象更為嚴重（圖2D），說明抑制Let-7i的表達會加重缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化。graphTD;A[正常對照組]-->A1[細胞呈鵝卵石樣扁平形態(tài)，邊界清晰，緊密排列成單層];B[OGD/R模型組]-->B1[細胞細長，呈梭形，細胞間連接松散，部分細胞回縮、脫落];C[Let-7i過表達組]-->C1[大部分細胞保持扁平形態(tài)，細胞間連接緊密，梭形細胞減少];D[Let-7i抑制組]-->D1[細胞呈典型梭形，細胞間連接嚴重破壞，細胞脫落嚴重];圖2：各組腦血管內皮細胞形態(tài)學變化（×200）：A為正常對照組；B為OGD/R模型組；C為Let-7i過表達組；D為Let-7i抑制組。5.1.2間質化標志物表達檢測采用免疫熒光和Westernblot技術對內皮細胞間質化標志物的表達進行檢測，結果如下：免疫熒光檢測結果：正常對照組中，內皮細胞標志物CD31和VE-Cadherin呈現強陽性表達，主要分布于細胞膜表面，呈現出清晰的線性熒光信號，表明細胞具有典型的內皮細胞特征（圖3A、3E）。而間質細胞標志物α-SMA和Fibronectin表達較弱，僅可見微弱的熒光信號（圖3I、3M）。在OGD/R模型組中，CD31和VE-Cadherin的熒光強度明顯減弱，細胞膜表面的線性熒光信號變得不連續(xù)（圖3B、3F），說明內皮細胞的特征性標志物表達下調。相反，α-SMA和Fibronectin的熒光強度顯著增強，細胞內可見明顯的絲狀或顆粒狀熒光信號（圖3J、3N），表明間質細胞標志物表達上調，進一步證實了缺血再灌注誘導了腦血管內皮細胞間質化。在Let-7i過表達組中，CD31和VE-Cadherin的熒光強度較OGD/R模型組有所增強，細胞膜表面的線性熒光信號恢復較為明顯（圖3C、3G），而α-SMA和Fibronectin的熒光強度則明顯減弱（圖3K、3O），提示Let-7i過表達能夠抑制缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化標志物表達的改變，維持內皮細胞的特性。在Let-7i抑制組中，CD31和VE-Cadherin的熒光強度進一步減弱，幾乎難以觀察到明顯的線性熒光信號（圖3D、3H），而α-SMA和Fibronectin的熒光強度則進一步增強（圖3L、3P），表明抑制Let-7i的表達會加劇缺血再灌注誘導的腦血管內皮細胞間質化標志物表達的異常變化。graphTD;A[正常對照組]-->A1[CD31和VE-Cadherin強陽性表達，呈線性熒光，α-SMA和Fibronectin表達弱];B[OGD/R模型組]-->B1[CD31和VE-Cadherin熒光減弱，α-SMA和Fibronectin熒光增強];C[Let-7i過表達組]-->C1[CD31和VE-Cadherin熒光增強，α-SMA和Fibronectin熒光減弱];D[Let-7i抑制組]-->D1[CD31和VE-Cadherin熒光極弱，α-SMA和Fibronectin熒光極強];圖3：各組腦血管內皮細胞間質化標志物免疫熒光染色結果（×400）：A-D為CD31免疫熒光染色；E-H為VE-Cadherin免疫熒光染色；I-L為α-SMA免疫熒光染色；M-P為Fibronectin免疫熒光染色。A、E、I、M為正常對照組；B、F、J、N為OGD/R模型組；C、G、K、O為Let-7i過表達組；D、H、L、P為Let-7i抑制組。Westernblot檢測結果：對各組細胞進行Westernblot檢測，結果顯示，與正常對照組相比，OGD/R模型組中CD31和VE-Cadherin蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），而α-SMA和Fibronectin蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）（圖4A、4B）。在Let-7i過表達組中，CD31和VE-Cadherin蛋白表達水平較OGD/R模型組明顯升高（P<0.05），α-SMA和Fibronectin蛋白表達水平則顯著降低（P<0.05）（圖4A、4B）。在Let-7i抑制組中，CD31和VE-Cadherin蛋白表達水平較OGD/R模型組進一步降低（P<0.05），α-SMA和Fibronectin蛋白表達水平則進一步升高（P<0.05）（圖4A、4B）。graphTD;A[正常對照組]-->A1[CD31和VE-Cadherin蛋白表達高，α-SMA和Fibronectin蛋白表達低];B[OGD/R模型組]-->B1[CD31和VE-Cadherin蛋白表達顯著降低，α-SMA和Fibronectin蛋白表達顯著升高];C[Let-7i過表達組]-->C1[CD31和VE-Cadherin蛋白表達較OGD/R組升高，α-SMA和Fibronectin蛋白表達降低];D[Let-7i抑制組]-->D1[CD31和VE-Cadherin蛋白表達較OGD/R組進一步降低，α-SMA和Fibronectin蛋白表達進一步升高];圖4：各組腦血管內皮細胞間質化標志物Westernblot檢測結果：A為蛋白條帶圖；B為蛋白表達水平統(tǒng)計分析圖。*P<0.05，**P<0.01vs正常對照組；#P<0.05，##P<0.01vsOGD/R模型組。綜合細胞形態(tài)學觀察和間質化標志物表達檢測結果，可以明確Let-7i對缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化具有重要的調節(jié)作用。過表達Let-7i能夠抑制腦血管內皮細胞間質化，維持內皮細胞的正常形態(tài)和標志物表達；而抑制Let-7i的表達則會促進腦血管內皮細胞間質化，加重細胞形態(tài)和標志物表達的異常改變。5.2Let-7i調節(jié)相關信號通路的實驗結果為深入探究Let-7i調節(jié)缺血再灌注后腦血管內皮細胞間質化的內在機制，對可能涉及的關鍵信號通路進行了全面檢測與深入分析。采用Westernblot技術，對TGF-β信號通路中的關鍵蛋白p-Smad2/3和Smad2/3的表達水平進行了精確測定。實驗結果清晰顯示，與正常對照組相比，OGD/R模型組中p-Smad2/3蛋白的表達水平顯著上調（P<0.01），這表明在缺血再灌注條件下，TGF-β信號通路被強烈激活，進而有力地誘導了腦血管內皮細胞間質化的發(fā)生。在Let-7i過表達組中，p-Smad2/3蛋白的表達水平較OGD/R模型組顯著降低（P<0.05），這充分說明Let-7i過表達能夠有效抑制TGF-β信號通路的激活，從而顯著抑制腦血管內皮細胞間質化的進程。與之相反，在Let-7i抑制組中，p-Smad2/3蛋白的表達水平較OGD/R模型組進一步升高（P<0.05），這明確表明抑制Let-7i的表達會進一步增強TGF-β信號通路的活性，進而加劇腦血管內皮細胞間質化的程度（圖5A、5B）。graphTD;A[正常對照組]-->A1[p-Smad2/3蛋白表達低];B[OGD/R模型組]-->B1[p-Smad2/3蛋白表達顯著上調];C[Let-7i過表達組]-->C1[p-Smad2/3蛋白表達較OGD/R組降低];D[Let-7i抑制組]-->D1[p-Smad2/3蛋白表達較OGD/R組進一步升高];圖5：各組腦血管內皮細胞TGF-β信號通路關鍵蛋白Westernblot檢測結果：A為蛋白條帶圖；B為蛋白表達水平統(tǒng)計分析圖。*P<0.05，**P<0.01vs正常對照組；#P<0.05，##P<0.01vsOGD/R模型組。對于Notch信號通路，通過Westernblot技術檢測了NICD（Notch胞內結構域）和Hes1（Notch信號通路下游靶基因）的蛋白表達水平。結果顯示，OGD/R模型組中NICD和Hes1蛋白的表達水平較正常對照組顯著升高（P<0.01），這清晰地表明缺血再灌注激活了Notch信號通路。在Let-7i過表達組中，NICD和Hes1蛋白的表達水平較OGD/R模型組顯著降低（P<0.05），這充分說明Let-7i過表達能夠有效抑制Notch信號通路的激活，從而抑制腦血管內皮細胞間質化。在Let-7i抑制組中，NICD和Hes1蛋白的表達水平較OGD/R模型組進一步升高（P<0.05）