TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的協(xié)同抑制效應(yīng)與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在全球范圍內(nèi)，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居前列，死亡率更是居高不下。卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，癌細(xì)胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度極大，預(yù)后情況不容樂(lè)觀，5年生存率僅在30%左右。卵巢癌不僅對(duì)患者的生理造成嚴(yán)重傷害，引發(fā)腹痛、貧血、消瘦等癥狀，還對(duì)患者的心理產(chǎn)生巨大影響，給患者及其家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此，深入探索卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更為有效的治療方法，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要課題。SKOV3細(xì)胞系作為一種常見(jiàn)的卵巢癌細(xì)胞系模型，來(lái)源于卵巢癌患者腹水和漿液性囊腺癌，具有典型的卵巢癌細(xì)胞特征，在卵巢癌的研究中具有重要價(jià)值。通過(guò)對(duì)SKOV3細(xì)胞的研究，能夠深入了解卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括增殖、遷移、侵襲等過(guò)程，為揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵線索，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)新型治療方法和篩選有效治療藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｄ[瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，這一過(guò)程涉及多種血管生成因子的參與。血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）和內(nèi)皮抑素（Endostatin）作為重要的內(nèi)源性血管生成抑制劑，在腫瘤血管生成的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TSP-1是一種多功能糖蛋白，可通過(guò)多種途徑抑制血管生成。它能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；TSP-1還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少新生血管的形成。Endostatin則是膠原蛋白ⅩⅧ的C末端裂解產(chǎn)物，它能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面已顯示出一定的效果，但仍存在局限性。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注多種血管生成抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的效果。聯(lián)合使用TSP-1和Endostatin，可能通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同抑制腫瘤血管生成，從而更有效地抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用，有助于深入了解兩者的協(xié)同作用機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。這不僅能夠豐富卵巢癌的治療手段，提高治療效果，還可能為其他惡性腫瘤的治療提供借鑒，具有重要的臨床意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在卵巢癌的研究領(lǐng)域，SKOV3細(xì)胞作為經(jīng)典的卵巢癌細(xì)胞系模型，一直是眾多研究的焦點(diǎn)。許多學(xué)者圍繞SKOV3細(xì)胞的生物學(xué)特性展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力。通過(guò)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖機(jī)制的研究，揭示了多種信號(hào)通路如PI3K/Akt、MAPK等在其中的關(guān)鍵作用，為后續(xù)探討TSP-1和Endostatin對(duì)其抑制作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。關(guān)于TSP-1對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的作用，已有研究表明，TSP-1能夠顯著抑制SKOV3細(xì)胞的增殖。通過(guò)與SKOV3細(xì)胞表面的CD36等受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而減少細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，TSP-1可通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠TSP-1處理，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積和重量顯著降低，表明TSP-1在體內(nèi)也具有抑制卵巢癌生長(zhǎng)的作用。Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的影響也有諸多研究。Endostatin能夠特異性地作用于SKOV3細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移。它通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素等受體結(jié)合，阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號(hào)通路的傳導(dǎo)，使內(nèi)皮細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制血管生成。Endostatin還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少腫瘤血管的數(shù)量，從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，將Endostatin加入到SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠Endostatin治療，腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，且腫瘤組織中的微血管密度顯著降低。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的影響。有研究表明，聯(lián)合使用TSP-1和Endostatin能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，更有效地抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。兩者可能通過(guò)不同的作用機(jī)制，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫瘤血管生成，如TSP-1抑制VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)，Endostatin抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而共同發(fā)揮更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合使用TSP-1和Endostatin的荷瘤小鼠，腫瘤的生長(zhǎng)抑制效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin的小鼠。盡管目前在TSP-1和Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的作用研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。大部分研究主要集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)于其在人體中的具體作用機(jī)制和療效還缺乏充分的臨床研究驗(yàn)證。目前對(duì)于TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用的最佳劑量、作用時(shí)間以及聯(lián)合治療方案等還需要進(jìn)一步優(yōu)化和探索。TSP-1和Endostatin在體內(nèi)的穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)等方面的研究也相對(duì)較少，這些問(wèn)題都限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探討TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用，并揭示其潛在的作用機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體研究?jī)?nèi)容如下：觀察TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用：通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法、EdU法等，檢測(cè)不同濃度的TSP-1、Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合作用于SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力的變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，明確兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果是否優(yōu)于單獨(dú)使用。利用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等，觀察TSP-1和Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合處理后，SKOV3細(xì)胞遷移能力的改變，分析兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞遷移的影響。通過(guò)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，如Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)，研究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的作用，觀察細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的數(shù)量和形態(tài)變化。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析TSP-1和Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合作用下，SKOV3細(xì)胞凋亡率的變化，確定兩者聯(lián)合是否能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞抑制作用的機(jī)制：采用Westernblot、Real-timePCR等技術(shù)，檢測(cè)與腫瘤血管生成相關(guān)的信號(hào)通路蛋白和基因的表達(dá)，如VEGF、PI3K/Akt、MAPK等，分析TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)這些信號(hào)通路的影響，探討其抑制腫瘤血管生成的分子機(jī)制。研究TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用對(duì)SKOV3細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響，如CyclinD1、p21等，明確兩者聯(lián)合是否通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞增殖。通過(guò)免疫熒光、免疫組化等方法，觀察TSP-1和Endostatin聯(lián)合處理后，SKOV3細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位變化，如Bcl-2、Bax、Caspase-3等，深入探究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)等多種研究方法，全面深入地探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)CCK-8法和EdU法，精確檢測(cè)不同濃度的TSP-1、Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合作用于SKOV3細(xì)胞后的增殖能力變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，直觀展示細(xì)胞增殖情況，從而明確兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞在遷移過(guò)程中的行為變化，分析TSP-1和Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合處理后對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響。借助Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)，研究細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的數(shù)量和形態(tài)變化，深入探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析細(xì)胞凋亡率的變化，確定兩者聯(lián)合是否能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。分子生物學(xué)技術(shù)也是本研究的重要手段。利用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)與腫瘤血管生成相關(guān)的信號(hào)通路蛋白以及細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，明確蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。通過(guò)Real-timePCR技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平，從基因?qū)用娣治鯰SP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)腫瘤血管生成、細(xì)胞周期和凋亡的影響。運(yùn)用免疫熒光和免疫組化方法，觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和定位變化，進(jìn)一步深入探究其作用機(jī)制。技術(shù)路線如圖1-1所示，首先復(fù)蘇并培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行分組處理。將細(xì)胞分為對(duì)照組、TSP-1組、Endostatin組以及TSP-1聯(lián)合Endostatin組。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，分別采用CCK-8法和EdU法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的增殖情況；在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察并統(tǒng)計(jì)遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量；在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。同時(shí)，提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)和RNA，利用Westernblot和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平，運(yùn)用免疫熒光和免疫組化方法觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位變化。最后，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、分組處理、各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)研究流程]二、TSP-1、Endostatin及卵巢癌SKOV3細(xì)胞概述2.1TSP-1的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）是一種重要的多功能糖蛋白，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的特點(diǎn)，編碼基因位于15q15上，TSP-1是一種分子量約為450kd的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，存在于血小板和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中。在透射電鏡下，其三聚體的每條單鏈均呈現(xiàn)出特定的結(jié)構(gòu)，由球狀氨基末端、球狀羧基末端構(gòu)成，中間連以細(xì)長(zhǎng)、易彎曲的桿狀臂。從功能區(qū)的角度來(lái)看，根據(jù)TSP-1與其他分子的相互作用，可將每條單鏈細(xì)致地分成6個(gè)功能區(qū)。末端肝素結(jié)合區(qū)，這一區(qū)域能夠與肝素等物質(zhì)結(jié)合，參與細(xì)胞間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)。前膠原同源區(qū)，與I型前膠原區(qū)膠原同源的片段，在維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面可能發(fā)揮重要作用。typeI序列，與備解素同源含有3個(gè)重復(fù)序列的I型重復(fù)區(qū)，其在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞識(shí)別等過(guò)程中具有潛在的功能。typelI~列，與表皮生長(zhǎng)因子同源含有3個(gè)重復(fù)序列的Ⅱ型重復(fù)區(qū)，可能參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過(guò)程。type]II序列，與鈣調(diào)素同源含有7個(gè)結(jié)合Ca2的重復(fù)序列的Ⅲ型重復(fù)區(qū)，通過(guò)與鈣離子的結(jié)合，調(diào)節(jié)TSP-1的結(jié)構(gòu)和功能。COOH末端細(xì)胞結(jié)合區(qū)，在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附以及細(xì)胞間的通訊中起著重要作用。在功能方面，TSP-1具有抑制血管生成的重要功能。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度依賴于新生血管的形成，而TSP-1能夠通過(guò)多種途徑有效地抑制這一過(guò)程。TSP-1可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體如CD36等特異性結(jié)合，這種結(jié)合能夠阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子的信號(hào)傳導(dǎo)。VEGF是一種關(guān)鍵的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新生血管的形成。當(dāng)TSP-1與CD36結(jié)合后，能夠干擾VEGF與其受體的相互作用，抑制下游信號(hào)通路的激活，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。TSP-1還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少新生血管的形成。它能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，進(jìn)而破壞新生血管的結(jié)構(gòu)和功能。在細(xì)胞凋亡方面，TSP-1同樣發(fā)揮著誘導(dǎo)作用。在腫瘤細(xì)胞中，TSP-1可以通過(guò)與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號(hào)通路。研究表明，TSP-1能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，它能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)cl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)TSP-1上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)時(shí)，能夠打破細(xì)胞內(nèi)凋亡和抗凋亡的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。TSP-1還可以激活caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，直接引發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。TSP-1在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中也扮演著重要角色。通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，TSP-1能夠激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。它可以抑制CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而減少細(xì)胞的增殖。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。當(dāng)TSP-1抑制CyclinD1的表達(dá)時(shí)，能夠阻止CDK的激活，使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。2.2Endostatin的結(jié)構(gòu)、功能與作用機(jī)制內(nèi)皮抑素（Endostatin）作為一種重要的內(nèi)源性血管生成抑制劑，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的功能和作用機(jī)制。Endostatin是膠原蛋白ⅩⅧ的C末端裂解產(chǎn)物，是一種分子量約為20kDa的蛋白質(zhì)，由184個(gè)氨基酸組成。其氨基酸序列高度保守，不同物種之間具有較高的同源性。Endostatin的結(jié)構(gòu)表面存在一個(gè)由11個(gè)精氨酸殘基組成的堿性區(qū)域，這一區(qū)域是其肝素結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)與肝素的高親和力結(jié)合，Endostatin能夠與血管生成因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合肝素，從而發(fā)揮抑制血管生成的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Endostatin序列中由其N端第1、3、11位3個(gè)組氨酸及第76位的天冬氨酸殘基組成鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，鋅與Endostatin的N端環(huán)繞形成一個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)。然而，后續(xù)研究表明，Endostatin抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及腫瘤的生長(zhǎng)并不依賴于鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。在功能方面，Endostatin具有顯著的抑制血管生成功能。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，Endostatin能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)其增殖、遷移和存活產(chǎn)生抑制作用。Kim等學(xué)者的研究表明，Endostatin能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穿透人工基底膜的能力，且抑制效果呈劑量依賴關(guān)系。這表明Endostatin能夠直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，從而阻礙新生血管的形成。在雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實(shí)驗(yàn)中，用大腸桿菌或桿狀病毒表達(dá)的Endostatin均顯示出對(duì)雞胚血管生成有明顯抑制作用，且未見(jiàn)毒性反應(yīng)。這進(jìn)一步證實(shí)了Endostatin在體內(nèi)對(duì)血管生成的抑制作用。Endostatin還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。許多研究表明，Endostatin可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。它能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡和抗凋亡的平衡，促使腫瘤細(xì)胞走向凋亡。Bcl-2和Bcl-XL是細(xì)胞內(nèi)重要的抗凋亡蛋白，它們能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Endostatin下調(diào)它們的表達(dá)時(shí)，能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Endostatin還可以激活細(xì)胞內(nèi)的其他凋亡信號(hào)通路，如通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的接頭蛋白Shb受體的SH2區(qū)域結(jié)合，激活酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞G1期阻滯，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Endostatin發(fā)揮作用的機(jī)制是多方面的。它可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）受體KDR/Flk-1酪氨酸磷酸化，從而抑制VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，阻斷VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK活性。VEGF是一種關(guān)鍵的促血管生成因子，它通過(guò)與受體結(jié)合，激活下游的ERK信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。當(dāng)Endostatin抑制VEGF受體的酪氨酸磷酸化時(shí)，能夠阻斷VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。Endostatin能與基質(zhì)金屬蛋白酶2前體蛋白（pro-MMP2）結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合體，阻止pro-MMP2的激活，并抑制MMP2和MMP1的催化活性，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，它們?cè)谘苌珊湍[瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Endostatin通過(guò)抑制MMPs的活性，能夠減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的侵襲。2.3卵巢癌SKOV3細(xì)胞的特性與研究現(xiàn)狀卵巢癌SKOV3細(xì)胞系在卵巢癌的研究領(lǐng)域中占據(jù)著至關(guān)重要的地位，它為深入探究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療方法提供了不可或缺的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀KOV3細(xì)胞系來(lái)源于卵巢癌患者腹水和漿液性囊腺癌，具有典型的卵巢癌細(xì)胞特征。在形態(tài)學(xué)上，SKOV3細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間緊密相連，形成典型的上皮細(xì)胞樣單層排列。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富。這種形態(tài)特征與卵巢癌組織中的癌細(xì)胞形態(tài)具有高度的相似性，為研究卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為提供了直觀的觀察對(duì)象。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，SKOV3細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。在適宜的培養(yǎng)條件下，如在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞能夠迅速增殖，其倍增時(shí)間相對(duì)較短。研究表明，SKOV3細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，這使得在實(shí)驗(yàn)中能夠快速獲得大量的細(xì)胞用于后續(xù)研究。SKOV3細(xì)胞還具有較強(qiáng)的貼壁能力，能夠在培養(yǎng)瓶底部迅速貼壁生長(zhǎng)，形成緊密的細(xì)胞單層。這種貼壁生長(zhǎng)特性有助于細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在卵巢癌的研究中，SKOV3細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于多個(gè)方面。許多學(xué)者利用SKOV3細(xì)胞研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)對(duì)SKOV3細(xì)胞的基因表達(dá)譜、信號(hào)通路等方面的研究，揭示了多種與卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，SKOV3細(xì)胞中存在多種信號(hào)通路的異常激活，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的異常激活與細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)。在卵巢癌治療藥物的篩選和研發(fā)中，SKOV3細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用。通過(guò)將不同的藥物作用于SKOV3細(xì)胞，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等變化，能夠初步評(píng)估藥物的療效和作用機(jī)制，為卵巢癌的臨床治療提供重要的參考依據(jù)。耐藥性是卵巢癌治療過(guò)程中面臨的一個(gè)重要問(wèn)題，SKOV3細(xì)胞在耐藥性研究方面也具有重要價(jià)值。目前已經(jīng)建立了多種SKOV3耐藥細(xì)胞株，如SKOV3/DDP（順鉑耐藥株）、SKOV3/TPT（拓?fù)涮婵的退幹辏?、SKOV3/Erl（艾洛替尼耐藥株）等。這些耐藥細(xì)胞株的建立，為研究卵巢癌耐藥機(jī)制提供了重要的模型。研究表明，SKOV3耐藥細(xì)胞株的耐藥機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括藥物外排增加、細(xì)胞凋亡抑制、信號(hào)通路異常等。SKOV3/DDP細(xì)胞株中，P-糖蛋白（Pgp）等藥物外排泵的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥性；在SKOV3/Erl細(xì)胞株中，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）相關(guān)信號(hào)通路的異常激活，使得細(xì)胞對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。對(duì)這些耐藥機(jī)制的深入研究，有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略，克服卵巢癌的耐藥問(wèn)題。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在含有10%胎牛血清（FBS）的McCoy`s5A培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，可保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞傳代比例為1:4-1:6，每周換液2-3次，傳代次數(shù)控制在20代以內(nèi)，以確保細(xì)胞特性的穩(wěn)定。主要試劑：血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）和內(nèi)皮抑素（Endostatin）均購(gòu)自Sigma公司，純度大于95%，以無(wú)菌PBS溶解配制成1mg/mL的儲(chǔ)存液，-20℃保存。CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，用于細(xì)胞增殖檢測(cè)，其主要成分包括WST-8以及電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS），可通過(guò)檢測(cè)生成的甲臜產(chǎn)物數(shù)量來(lái)間接反映活細(xì)胞數(shù)量。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，其中AnnexinV可與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的指標(biāo)，PI則用于區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡中晚期細(xì)胞。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，它模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的成分，能夠?yàn)榧?xì)胞侵襲提供近似體內(nèi)的環(huán)境。Transwell小室購(gòu)自Costar公司，用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，其聚碳酸酯膜具有一定的孔徑，可允許細(xì)胞通過(guò)，便于觀察細(xì)胞的遷移和侵襲能力。RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白，含有多種去污劑和蛋白酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞并防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定蛋白濃度，利用雙縮脲反應(yīng)原理，通過(guò)測(cè)定絡(luò)合物的吸光度來(lái)推算蛋白質(zhì)濃度。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白轉(zhuǎn)膜，具有較高的蛋白結(jié)合能力和化學(xué)穩(wěn)定性。ECL發(fā)光液購(gòu)自Bio-Rad公司，用于Westernblot實(shí)驗(yàn)的顯色，能夠與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細(xì)胞正常生長(zhǎng)。超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司），提供無(wú)菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染。倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和分布情況。酶標(biāo)儀（Bio-Tek），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值，從而分析細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，對(duì)不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行分群和定量。電泳儀（Bio-Rad）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad），分別用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作，將蛋白樣品按分子量大小分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于檢測(cè)ECL發(fā)光液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，拍攝Westernblot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖像。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1SKOV3細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定從液氮罐中取出凍存的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，期間不斷輕輕晃動(dòng)凍存管，確保細(xì)胞受熱均勻。待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10mL完全培養(yǎng)液（McCoy`s5A培養(yǎng)液添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗）的15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。用5mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用1×PBS（T25cm2培養(yǎng)瓶添加約2-3mL）洗滌細(xì)胞1-2次，以去除殘余的培養(yǎng)液和血清。加入1mL0.25%胰蛋白酶溶液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻覆蓋細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓不貼壁，輕輕晃動(dòng)和敲擊培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大量細(xì)胞脫離時(shí)，立即加入2mL完全培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫壁并形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm室溫離心4分鐘。離心后，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照1:4-1:6的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)液至合適體積，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為確保使用的SKOV3細(xì)胞特性穩(wěn)定且準(zhǔn)確無(wú)誤，需對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）分型技術(shù)對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)行鑒定。具體操作如下：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)液。按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書，提取細(xì)胞的基因組DNA。使用針對(duì)多個(gè)STR位點(diǎn)的引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增SKOV3細(xì)胞的STR位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，通過(guò)檢測(cè)不同STR位點(diǎn)的片段長(zhǎng)度，得到SKOV3細(xì)胞的STR圖譜。將得到的STR圖譜與ATCC等權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)中SKOV3細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)STR圖譜進(jìn)行比對(duì)，如果兩者的圖譜高度一致，即表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為SKOV3細(xì)胞。同時(shí)，還可以通過(guò)觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富等，進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞的特性。3.2.2TSP-1和Endostatin的制備與處理將購(gòu)買的TSP-1和Endostatin粉末從-20℃冰箱取出，放置在冰上緩慢解凍。待粉末完全解凍后，用無(wú)菌PBS將其溶解，配制成1mg/mL的儲(chǔ)存液。將儲(chǔ)存液分裝到無(wú)菌的EP管中，每管100μL，避免反復(fù)凍融對(duì)蛋白活性的影響。將分裝后的EP管再次放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ谔幚鞸KOV3細(xì)胞時(shí)，將TSP-1和Endostatin儲(chǔ)存液用完全培養(yǎng)液稀釋成不同的濃度。設(shè)置TSP-1的濃度梯度為0、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，Endostatin的濃度梯度為0、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。對(duì)于聯(lián)合處理組，將不同濃度的TSP-1和Endostatin按照相應(yīng)比例混合。例如，在TSP-110μg/mL與Endostatin20μg/mL的聯(lián)合處理組中，將TSP-1儲(chǔ)存液和Endostatin儲(chǔ)存液用完全培養(yǎng)液稀釋后混合，使最終混合液中TSP-1的濃度為10μg/mL，Endostatin的濃度為20μg/mL。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度TSP-1、Endostatin以及兩者聯(lián)合的完全培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將6孔板放回培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。3.2.3細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用。MTT法實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔加入100μL，即每孔接種500個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，按照分組分別加入含有不同濃度TSP-1、Endostatin以及兩者聯(lián)合的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等體積的完全培養(yǎng)液。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前4小時(shí)，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。CCK-8法實(shí)驗(yàn)步驟如下：同樣將SKOV3細(xì)胞調(diào)整濃度為5×103個(gè)/mL，接種到96孔板中，每孔100μL。培養(yǎng)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入不同處理的完全培養(yǎng)液。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白對(duì)照組。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前，向每孔加入10μLCCK-8溶液。將96孔板繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，具體孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式與MTT法相同。MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。用DMSO溶解沉積在細(xì)胞中的甲臜后，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。CCK-8法的原理是試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。3.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測(cè)TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響。AnnexinV-FITC/PI雙染法實(shí)驗(yàn)流程如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。貼壁后，按照分組加入不同濃度TSP-1、Endostatin以及兩者聯(lián)合的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的完全培養(yǎng)液。將6孔板在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，300-500g離心5min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次300-400g，2-8℃離心5min。按試劑公司說(shuō)明取相應(yīng)量的熒光染料標(biāo)記結(jié)合溶液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度大約為（1-5）×10?/mL。向100μL細(xì)胞混懸液中加入適量的熒光標(biāo)記的AnnexinV染料，輕輕混勻后室溫或2-8℃避光條件下孵育5-15min。再加入適量的核酸染料PI，輕輕混勻后室溫或2-8℃避光條件下孵育1-5min。加入400μLPBS，輕輕混勻。將細(xì)胞過(guò)200目篩網(wǎng)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。所以，通過(guò)AnnexinV和PI雙染的方法，就可以把早期凋亡的細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）與晚期凋亡加壞死的細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）區(qū)分開(kāi)來(lái)，活細(xì)胞則表現(xiàn)為AnnexinV-/PI-。TUNEL法實(shí)驗(yàn)流程（以細(xì)胞樣本為例）：將SKOV3細(xì)胞接種到細(xì)胞爬片上，放入6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。貼壁后，進(jìn)行不同處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后，用PBS洗滌2次細(xì)胞爬片，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60min。加入破膜液（TritonX-100）破膜2次，每次5min，PBS清洗3次，每次2min。加TUNEL檢測(cè)液，37°C濕盒避光孵育60min。將細(xì)胞爬片浸入PBS中，室溫放置5min，重復(fù)洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶可以使染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可通過(guò)熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。3.2.5細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)分析TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。貼壁后，按照分組加入不同濃度TSP-1、Endostatin以及兩者聯(lián)合的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的完全培養(yǎng)液。將6孔板在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，300-500g離心5min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次300-400g，2-8℃離心5min。加入適量的70%乙醇，輕輕混勻，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞300-500g離心5min，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞一次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），輕輕混勻，37℃避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞周期各時(shí)相的比例。細(xì)胞周期可分為G1期、S期和G2/M期。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，DNA含量會(huì)發(fā)生變化。PI是一種核酸染料，能夠與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI染色后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況。正常情況下，大部分細(xì)胞處于G1期，少量細(xì)胞處于S期和G2/M期。當(dāng)細(xì)胞受到TSP-1和Endostatin作用后，若細(xì)胞周期發(fā)生改變，如細(xì)胞周期阻滯在G1期，則G1期細(xì)胞比例會(huì)增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少；若細(xì)胞周期阻滯在S期或G2/M期，則相應(yīng)時(shí)期的細(xì)胞比例會(huì)增加。3.2.6分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)利用Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，以探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞作用的分子機(jī)制。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞接種到6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。貼壁后，按照分組加入不同濃度TSP-1、Endostatin以及兩者聯(lián)合的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的完全培養(yǎng)液。將6孔板在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次。按照0.1ml/10?cells加入適量的RIPA裂解液（含有1%的蛋白酶抑制劑），用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后轉(zhuǎn)入到離心管中。將離心管放在冰上30min以充分裂解細(xì)胞，然后4℃條件下，10000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)新的離心管中，蛋白在上清中，若暫時(shí)不做任何處理可以-80℃保存。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，具體步驟如下：根據(jù)樣品數(shù)量的多少，將BCA試劑的A和B液按A:B=50:1的比例配制適量的BCA工作液。把蛋白標(biāo)準(zhǔn)品粉末加入1.5ml離心管，加入超純水充分溶解后配制成20mg/m1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在-20℃保存，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取適量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl以及適量體積蛋白樣品加到96孔板中，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足各孔體積至20μl，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，最后向各孔加入200μlBCA工作液，在37恒溫箱放置20-30分鐘。在A562nm用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（OD值）。在excel中處理所得數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及待測(cè)蛋白樣品OD值計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。根據(jù)計(jì)算得到的蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS上樣緩沖液按1:1或1:2比例混合，100°C加熱5min，使蛋白充分變性。安裝電泳裝置，根據(jù)待分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般10％的凝膠可用于16-70kDa蛋白質(zhì)的分離。將分離膠緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可，在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min，聚合后，可見(jiàn)在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HClpH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。配制濃縮膠，將濃縮膠倒入玻璃夾層中直至頂部，選擇合適的梳子插入濃縮膠中，室溫放置30min，使其聚合。小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液。用50μ3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。在細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于MTT法和CCK-8法所得的吸光值數(shù)據(jù)，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同組之間的差異；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率后，同樣進(jìn)行上述統(tǒng)計(jì)分析，以確定不同濃度的TSP-1、Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合處理對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖抑制率的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法得到的細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較各組之間的差異；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，明確不同處理組對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響。細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得到的細(xì)胞周期各時(shí)相比例數(shù)據(jù)，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，然后采用單因素方差分析比較不同組之間的差異，以判斷TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞周期分布的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。對(duì)這些相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較不同組之間的差異；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白、細(xì)胞周期蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的影響。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)P<0.01時(shí)，認(rèn)為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，嚴(yán)格按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的要求進(jìn)行操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用本研究通過(guò)MTT法和CCK-8法檢測(cè)了不同處理組SKOV3細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如表4-1和表4-2所示。MTT法結(jié)果顯示，在24小時(shí)時(shí)，隨著TSP-1和Endostatin濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。單獨(dú)使用TSP-1時(shí)，40μg/mL組的抑制率為（25.67±3.21）%；單獨(dú)使用Endostatin時(shí)，80μg/mL組的抑制率為（30.56±4.12）%。聯(lián)合處理組中，TSP-120μg/mL與Endostatin40μg/mL聯(lián)合組的抑制率達(dá)到（42.34±5.03）%，顯著高于單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin的同濃度組（P<0.05）。在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，各處理組的抑制率進(jìn)一步升高，聯(lián)合處理組的抑制效果依然明顯優(yōu)于單獨(dú)處理組。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果與MTT法趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)各處理組的細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖4-1所示。從曲線中可以直觀地看出，對(duì)照組細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，而TSP-1和Endostatin單獨(dú)處理組以及聯(lián)合處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減緩。聯(lián)合處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線位于單獨(dú)處理組下方，表明聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果更為顯著。在不同時(shí)間點(diǎn)，聯(lián)合處理組的抑制率均高于單獨(dú)處理組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異更加明顯。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用不僅具有濃度依賴性，還具有時(shí)間依賴性。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果逐漸增強(qiáng)。[此處插入表4-1MTT法檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率（x±s，%），表中清晰列出不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度TSP-1、Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合處理組的抑制率數(shù)據(jù)][此處插入表4-2CCK-8法檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率（x±s，%），表中清晰列出不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度TSP-1、Endostatin單獨(dú)及聯(lián)合處理組的抑制率數(shù)據(jù)][此處插入圖4-1不同處理組SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率（%），不同處理組用不同顏色曲線表示]4.2TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響為了探究TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響，本研究運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果如表4-3所示，對(duì)照組的早期凋亡率為（3.25±0.56）%，晚期凋亡率為（2.13±0.45）%。單獨(dú)使用TSP-1時(shí)，隨著濃度增加，早期凋亡率和晚期凋亡率均逐漸升高，40μg/mL組的早期凋亡率達(dá)到（10.56±1.23）%，晚期凋亡率為（7.65±1.02）%。單獨(dú)使用Endostatin時(shí)，80μg/mL組的早期凋亡率為（13.24±1.56）%，晚期凋亡率為（9.87±1.34）%。聯(lián)合處理組中，TSP-120μg/mL與Endostatin40μg/mL聯(lián)合組的早期凋亡率為（20.34±2.01）%，晚期凋亡率為（15.45±1.89）%，顯著高于單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin的同濃度組（P<0.05）。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡，且隨著藥物濃度的增加，凋亡誘導(dǎo)作用更加明顯。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果如圖4-2所示，對(duì)照組中可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而TSP-1和Endostatin單獨(dú)處理組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有所增加，聯(lián)合處理組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的綠色熒光標(biāo)記，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡的數(shù)量大幅增加。這進(jìn)一步證實(shí)了TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果如圖4-3所示。與對(duì)照組相比，TSP-1和Endostatin單獨(dú)處理組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高。聯(lián)合處理組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而B(niǎo)ax是促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是凋亡執(zhí)行蛋白，其激活是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。[此處插入表4-3AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞凋亡率（x±s，%），表中清晰列出不同處理組的早期凋亡率和晚期凋亡率數(shù)據(jù)][此處插入圖4-2TUNEL法檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞凋亡情況，圖中展示對(duì)照組、TSP-1組、Endostatin組、聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡圖像，陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光][此處插入圖4-3Westernblot檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，圖中展示Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的條帶圖，下方標(biāo)注蛋白相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)]4.3TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的阻滯作用通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理組的SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果如表4-4所示。對(duì)照組中，G1期細(xì)胞比例為（55.67±3.21）%，S期細(xì)胞比例為（28.56±2.13）%，G2/M期細(xì)胞比例為（15.77±1.56）%。單獨(dú)使用TSP-1時(shí)，隨著濃度增加，G1期細(xì)胞比例逐漸升高，40μg/mL組的G1期細(xì)胞比例達(dá)到（70.34±4.02）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)降低。單獨(dú)使用Endostatin時(shí)，80μg/mL組的G1期細(xì)胞比例為（75.23±4.56）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例也明顯下降。聯(lián)合處理組中，TSP-120μg/mL與Endostatin40μg/mL聯(lián)合組的G1期細(xì)胞比例高達(dá)（82.45±5.03）%，顯著高于單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin的同濃度組（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例則降至（10.23±1.23）%和（7.32±1.01）%。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同作用，使SKOV3細(xì)胞周期明顯阻滯在G1期。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精確調(diào)控。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，形成CyclinD1-CDK復(fù)合物，進(jìn)而激活CDK的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。當(dāng)細(xì)胞受到TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這使得CyclinD1-CDK復(fù)合物的形成減少，CDK的激酶活性無(wú)法有效激活，從而阻礙了細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它能夠與CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。在TSP-1聯(lián)合Endostatin處理組中，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高。升高的p21蛋白能夠與更多的CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步抑制CDK的活性，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，促使更多的細(xì)胞停滯在G1期。[此處插入表4-4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞周期分布（x±s，%），表中清晰列出不同處理組G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例數(shù)據(jù)]4.4TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響通過(guò)Westernblot和RT-PCR技術(shù)，對(duì)TSP-1聯(lián)合Endostatin處理后的SKOV3細(xì)胞中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以深入探究其作用機(jī)制。在腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路方面，結(jié)果顯示，對(duì)照組中VEGF蛋白和基因的表達(dá)水平較高。單獨(dú)使用TSP-1時(shí)，隨著濃度增加，VEGF蛋白和基因的表達(dá)水平逐漸降低。單獨(dú)使用Endostatin時(shí)，也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，80μg/mL組的VEGF表達(dá)水平顯著下降。聯(lián)合處理組中，TSP-120μg/mL與Endostatin40μg/mL聯(lián)合組的VEGF蛋白和基因表達(dá)水平降低最為明顯，顯著低于單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin的同濃度組（P<0.05）。PI3K/Akt信號(hào)通路中，p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平在對(duì)照組中較高。TSP-1和Endostatin單獨(dú)處理組中，p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平有所下降。聯(lián)合處理組中，p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同抑制VEGF的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制腫瘤血管生成。在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白方面，CyclinD1蛋白和基因的表達(dá)在對(duì)照組中處于較高水平。單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin時(shí)，CyclinD1的表達(dá)水平逐漸降低。聯(lián)合處理組中，CyclinD1的表達(dá)水平顯著低于單獨(dú)處理組。p21蛋白和基因的表達(dá)則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，在聯(lián)合處理組中表達(dá)水平顯著升高。這進(jìn)一步證實(shí)了TSP-1聯(lián)合Endostatin通過(guò)抑制CyclinD1的表達(dá)，上調(diào)p21的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制SKOV3細(xì)胞的增殖。在凋亡相關(guān)蛋白方面，Bcl-2蛋白和基因的表達(dá)在對(duì)照組中較高，而B(niǎo)ax和Caspase-3蛋白和基因的表達(dá)相對(duì)較低。單獨(dú)使用TSP-1或Endostatin時(shí)，Bcl-2的表達(dá)水平降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)水平升高。聯(lián)合處理組中，Bcl-2的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。[此處插入圖4-4Westernblot檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)，圖中展示VEGF、p-PI3K、p-Akt、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的條帶圖，下方標(biāo)注蛋白相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)][此處插入圖4-5RT-PCR檢測(cè)不同處理組SKOV3細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，圖中展示VEGF、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表達(dá)量柱狀圖，標(biāo)注統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果]五、討論5.1TSP-1聯(lián)合Endostatin抑制SKOV3細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)分析本研究結(jié)果表明，TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有顯著的協(xié)同抑制作用，在細(xì)胞增殖、凋亡、周期阻滯以及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)等多個(gè)方面均表現(xiàn)出比單獨(dú)使用更強(qiáng)的效果。在細(xì)胞增殖抑制方面，MTT法和CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致顯示，隨著TSP-1和Endostatin濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，且聯(lián)合處理組的抑制效果顯著優(yōu)于單獨(dú)處理組。這表明TSP-1和Endostatin聯(lián)合使用能夠更有效地抑制SKOV3細(xì)胞的增殖能力，使其生長(zhǎng)速度明顯減緩。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線也可以直觀地看出，聯(lián)合處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線位于單獨(dú)處理組下方，進(jìn)一步證實(shí)了這種協(xié)同抑制作用。這種協(xié)同效應(yīng)可能是由于TSP-1和Endostatin通過(guò)不同的作用機(jī)制，從多個(gè)角度干擾了SKOV3細(xì)胞的增殖過(guò)程。TSP-1通過(guò)與細(xì)胞表面的CD36等受體結(jié)合，抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而減少細(xì)胞的增殖；Endostatin則特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移，減少腫瘤血管的形成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，間接抑制SKOV3細(xì)胞的增殖。兩者聯(lián)合使用，能夠在細(xì)胞增殖的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，更有效地抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果均表明，TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。聯(lián)合處理組的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著高于單獨(dú)處理組，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也明顯增多。通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而B(niǎo)ax是促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是凋亡執(zhí)行蛋白，其激活是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡和抗凋亡的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。這種協(xié)同誘導(dǎo)凋亡的作用可能是由于TSP-1和Endostatin分別激活了不同的凋亡信號(hào)通路，或者增強(qiáng)了彼此對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活作用，從而共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞周期阻滯方面，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同作用，使SKOV3細(xì)胞周期明顯阻滯在G1期。聯(lián)合處理組的G1期細(xì)胞比例顯著高于單獨(dú)處理組，S期和G2/M期細(xì)胞比例則顯著降低。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精確調(diào)控，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，形成CyclinD1-CDK復(fù)合物，進(jìn)而激活CDK的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。當(dāng)細(xì)胞受到TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用后，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，使得CyclinD1-CDK復(fù)合物的形成減少，CDK的激酶活性無(wú)法有效激活，從而阻礙了細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它能夠與CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。在TSP-1聯(lián)合Endostatin處理組中，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高，能夠與更多的CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步抑制CDK的活性，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。這種協(xié)同的細(xì)胞周期阻滯作用，能夠有效抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，為卵巢癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。在相關(guān)基因和蛋白表達(dá)方面，TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)均產(chǎn)生了協(xié)同影響。在腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路中，聯(lián)合處理組能夠更顯著地抑制VEGF的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，從而抑制腫瘤血管生成。在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白方面，聯(lián)合處理組對(duì)CyclinD1的抑制作用和對(duì)p21的上調(diào)作用更為明顯，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。在凋亡相關(guān)蛋白方面，聯(lián)合處理組對(duì)Bcl-2的下調(diào)作用和對(duì)Bax、Caspase-3的上調(diào)作用更為顯著，表明其能夠更有效地促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，TSP-1聯(lián)合Endostatin通過(guò)多種途徑協(xié)同作用，從分子水平上對(duì)SKOV3細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著影響。TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的協(xié)同抑制效應(yīng)具有重要的意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。在卵巢癌的治療中，單一的治療方法往往存在局限性，難以取得理想的治療效果。而TSP-1和Endostatin聯(lián)合使用，能夠發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，從多個(gè)方面抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高治療效果。這種聯(lián)合治療策略為卵巢癌的治療提供了新的思路和方法，有望成為一種有效的治療手段。在臨床應(yīng)用中，可以進(jìn)一步研究TSP-1和Endostatin聯(lián)合治療的最佳劑量、作用時(shí)間以及聯(lián)合治療方案等，以優(yōu)化治療效果，減少不良反應(yīng)。還可以將TSP-1聯(lián)合Endostatin與其他治療方法，如化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，探索綜合治療方案，為卵巢癌患者提供更有效的治療選擇。5.2聯(lián)合抑制作用的機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，主要包括對(duì)血管生成、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。在血管生成方面，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，而TSP-1和Endostatin均為重要的內(nèi)源性血管生成抑制劑。TSP-1可通過(guò)多種途徑抑制血管生成，它能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體如CD36等結(jié)合，阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。TSP-1還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少新生血管的形成。Endostatin則特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖和遷移。它能與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素等受體結(jié)合，阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號(hào)通路的傳導(dǎo)，使內(nèi)皮細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制血管生成。Endostatin還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少腫瘤血管的數(shù)量。當(dāng)TSP-1和Endostatin聯(lián)合使用時(shí)，兩者可能通過(guò)不同的作用機(jī)制，從多個(gè)環(huán)節(jié)協(xié)同抑制腫瘤血管生成。TSP-1抑制VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)，Endostatin抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而共同發(fā)揮更強(qiáng)的抑制腫瘤血管生成的作用。本研究通過(guò)Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理組中VEGF蛋白和基因的表達(dá)水平顯著降低，PI3K/Akt信號(hào)通路中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平也顯著下降。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠協(xié)同抑制VEGF的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，從而有效抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞凋亡方面，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和抑制腫瘤的生長(zhǎng)具有重要意義。TSP-1和Endostatin均具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。TSP-1可以通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Endostatin也可以通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用于SKOV3細(xì)胞時(shí)，兩者可能通過(guò)不同的凋亡信號(hào)通路，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究中，通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法以及Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果均表明聯(lián)合處理組能夠顯著促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。聯(lián)合處理組中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。這表明TSP-1聯(lián)合Endostatin能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡和抗凋亡的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。這種協(xié)同誘導(dǎo)凋亡的作用，能夠有效減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在細(xì)胞周期方面，細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用能夠使SKOV3細(xì)胞周期明顯阻滯在G1期。細(xì)胞周期的調(diào)控涉及多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精確調(diào)節(jié)，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，形成CyclinD1-CDK復(fù)合物，進(jìn)而激活CDK的激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。當(dāng)細(xì)胞受到TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用后，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，使得CyclinD1-CDK復(fù)合物的形成減少，CDK的激酶活性無(wú)法有效激活，從而阻礙了細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它能夠與CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。在TSP-1聯(lián)合Endostatin處理組中，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高，能夠與更多的CyclinD1-CDK復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步抑制CDK的活性，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布以及Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果均證實(shí)了TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的阻滯作用。這種細(xì)胞周期阻滯作用，能夠有效抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，為卵巢癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制作用是通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同實(shí)現(xiàn)的。兩者在抑制血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期等方面的協(xié)同作用，為卵巢癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討TSP-1和Endostatin聯(lián)合作用的分子機(jī)制，優(yōu)化聯(lián)合治療方案，為卵巢癌患者帶來(lái)更好的治療效果。5.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究關(guān)于TSP-1聯(lián)合Endostatin對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞抑制作用的結(jié)果具有重要的臨床意義和廣闊的應(yīng)用前景。卵巢癌作為一種嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，其治療現(xiàn)狀仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，卵巢癌的主要治療方法包