SG15和ISG20在藍舌病病毒復制中的功能與機制探究一、引言1.1研究背景與意義藍舌病（Bluetongue，BT）是一種由藍舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的，主要影響反芻動物的病毒性傳染病，被國際獸疫局列為A類傳染病，在我國被列為一類動物疫病。BTV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，是一種蟲媒病毒，主要通過庫蠓等吸血昆蟲叮咬傳播，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)廣泛流行，且多發(fā)生于夏秋季節(jié)，此時庫蠓等媒介昆蟲大量繁殖，活動頻繁，大大增加了病毒的傳播幾率。BTV可感染牛、羊、鹿等多種反芻動物，其中綿羊最為易感，感染后常出現(xiàn)高燒、口腔潰瘍、頭部和頸部腫脹、呼吸困難、跛行等典型癥狀，嚴重時舌頭會變藍，病死率較高，可達2%-3%，有時甚至高達90%。患病動物即使存活，也可能出現(xiàn)長期發(fā)育不良的情況，對于懷孕母羊，還可能導致胎兒畸形，嚴重影響畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益。牛感染后通常臨床癥狀不明顯，但可作為病毒的攜帶者，持續(xù)向外界排毒，在藍舌病的傳播過程中起著重要的作用。在全球范圍內(nèi)，藍舌病的爆發(fā)給反芻動物養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。例如，2007年澳大利亞昆士蘭州爆發(fā)藍舌病疫情，大量牲畜死亡，對當?shù)匦竽翗I(yè)造成了沉重打擊；2016年歐洲多個國家也遭受藍舌病侵襲，眾多牲畜感染，嚴重影響了當?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展。在我國，隨著養(yǎng)羊業(yè)等反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，藍舌病的潛在威脅日益凸顯。一旦疫情爆發(fā)，不僅會導致動物發(fā)病和死亡，增加養(yǎng)殖成本，還可能影響畜產(chǎn)品的國際貿(mào)易，制約我國反芻動物養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。目前，對于藍舌病的防控主要依賴疫苗接種，但由于BTV存在多個血清型，各型之間無交叉免疫力，疫苗的研發(fā)和應用面臨諸多挑戰(zhàn)。因此，深入研究BTV的感染和復制機制，尋找有效的抗病毒靶點，對于藍舌病的防控具有重要的理論和實際意義。干擾素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes，ISGs）是在干擾素（Interferon，IFN）作用下誘導表達的一類基因，其編碼的蛋白在機體抗病毒免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。ISG15和ISG20是ISGs家族中的重要成員，已有研究表明，它們在多種病毒感染過程中展現(xiàn)出抗病毒活性。例如，ISG15可以通過共價結合靶蛋白分子，進行ISGylation修飾，干擾病毒復制的關鍵步驟，從而抑制HIV-1、偽狂犬病毒（PRV）等病毒的復制；ISG20具有3'-5'核酸外切酶活性，能夠降解病毒RNA，或通過增強IFN信號傳導，抑制流感病毒、丙型肝炎病毒等病毒的增殖。然而，關于ISG15和ISG20在BTV感染過程中的作用及其機制，目前尚未見報道。本研究旨在探討ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的作用及其機制，通過深入研究它們與BTV之間的相互作用關系，有望揭示BTV感染和復制的新機制，為藍舌病的防控提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點，具有重要的科學價值和應用前景。1.2藍舌病病毒概述藍舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）在病毒分類學上屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）。其病毒粒子呈二十面體對稱結構，無囊膜，直徑約為80-85nm，由雙層蛋白衣殼和核心組成。外層衣殼由VP2和VP5蛋白組成，它們在病毒與宿主細胞的識別和吸附過程中發(fā)揮關鍵作用；內(nèi)層衣殼則由VP3和VP7蛋白構成，對病毒的核心結構起到保護作用。病毒核心包含10個節(jié)段的雙鏈RNA（dsRNA），這些基因節(jié)段編碼7種結構蛋白（VP1-VP7）和5種非結構蛋白（NS1-NS5），各蛋白在病毒的復制、轉(zhuǎn)錄、裝配等過程中各司其職。BTV主要通過庫蠓等吸血昆蟲叮咬進行傳播，庫蠓在吸食感染動物的血液后，病毒會在庫蠓體內(nèi)進行增殖，當庫蠓再次叮咬健康動物時，就將病毒傳播給新的宿主。除了蟲媒傳播，BTV還可通過胎盤垂直傳播，懷孕母羊感染BTV后，病毒可經(jīng)胎盤感染胎兒，導致胎兒發(fā)育異常甚至死亡；公牛感染后，精液中也可能攜帶病毒，通過交配或人工授精的方式傳染給母牛。當BTV進入宿主動物體內(nèi)后，首先會感染巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞，病毒在這些細胞內(nèi)進行復制，進而引發(fā)機體的免疫反應。病毒感染會激活宿主的天然免疫應答，促使機體產(chǎn)生干擾素等細胞因子，這些細胞因子可以抑制病毒的復制，同時也會引發(fā)炎癥反應。隨著病毒的進一步擴散，會感染口腔、鼻腔、胃腸道等部位的黏膜上皮細胞，導致這些部位出現(xiàn)病變，如口腔潰瘍、出血、壞死等。在感染后期，病毒可能會侵犯心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，引起心臟功能異常、神經(jīng)癥狀等，嚴重時可導致動物死亡。1.3SG15和ISG20相關背景干擾素刺激基因15（Interferon-StimulatedGene15，ISG15）是一種細胞內(nèi)泛素樣蛋白，其編碼基因位于人類1號染色體上。ISG15蛋白大小約為15KD，成熟的ISG15包含兩個泛素樣結構域，通過短鉸鏈區(qū)連接。ISG15的表達主要受干擾素α/β（IFN-α/β）的誘導，在病毒感染、細菌感染等應激情況下，機體產(chǎn)生的IFN-α/β與細胞表面受體結合，激活JAK-STAT信號通路，進而誘導ISG15基因的轉(zhuǎn)錄和表達。在宿主免疫中，ISG15發(fā)揮著重要的抗病毒作用，其主要通過ISGylation修飾來實現(xiàn)這一功能。ISGylation修飾過程與泛素化類似，在E1激活酶、E2結合酶和E3連接酶的依次作用下，ISG15與靶蛋白分子通過共價結合，從而改變靶蛋白的功能、穩(wěn)定性或細胞定位。多項研究表明，ISG15可以抑制多種病毒的復制。例如，在HIV-1感染過程中，ISG15能夠修飾HIV-1的Gag蛋白，干擾病毒顆粒的組裝和釋放，從而抑制病毒的復制；在偽狂犬病毒（PRV）感染中，ISG15通過競爭性抑制病毒蛋白的泛素化，影響病毒的增殖。此外，ISG15還參與免疫調(diào)節(jié)，它可以負調(diào)控I型IFN信號通路，避免免疫反應過度激活，維持機體免疫平衡。在抗結核免疫方面，ISG15作為一種誘導γ-干擾素分泌的因子，在最優(yōu)化抗結核免疫中起著至關重要的作用，缺乏ISG15會減少淋巴細胞產(chǎn)生γ-干擾素，增加機體對分枝桿菌病的易感性。目前，對于ISG15的研究主要集中在其抗病毒機制以及在各種病毒感染性疾病中的作用。研究人員通過基因敲除、過表達等技術手段，深入探究ISG15與病毒之間的相互作用關系，不斷揭示其在抗病毒免疫中的新功能和作用機制。同時，ISG15作為潛在的治療靶點，也受到了廣泛關注，為開發(fā)新型抗病毒藥物提供了新的思路。干擾素刺激基因20（Interferon-StimulatedGene20，ISG20）是由1型、2型干擾素誘導產(chǎn)生的一種蛋白，其相對分子質(zhì)量約為20KD。ISG20基因位于人類12號染色體上，其編碼的蛋白具有獨特的3'-5'核酸外切酶活性。在病毒感染宿主細胞后，干擾素被誘導產(chǎn)生并激活下游信號通路，促使ISG20基因表達上調(diào)。ISG20在宿主抗病毒免疫中主要通過兩種方式發(fā)揮作用。一方面，憑借其3'-5'核酸外切酶活性，ISG20能夠直接降解病毒的單鏈RNA或DNA，破壞病毒的遺傳物質(zhì)，從而抑制病毒的復制。例如，在丙型肝炎病毒（HCV）感染中，ISG20可以特異性地識別并降解HCV的RNA，阻礙病毒的復制進程；另一方面，ISG20可以增強IFN信號傳導，促進干擾素刺激基因的表達，放大機體的抗病毒免疫反應。在偽狂犬病病毒（PRV）感染細胞后，ISG20的表達上調(diào)，通過增強IFN-β的表達及IFN下游信號，抑制PRV的增殖。近年來，關于ISG20的研究不斷深入，除了在病毒性肝炎、流感病毒、偽狂犬病毒等病毒感染中的作用研究外，還涉及到ISG20與宿主細胞內(nèi)其他蛋白的相互作用，以及其在病毒感染過程中對細胞代謝、信號通路等方面的影響。這些研究有助于全面了解ISG20在抗病毒免疫中的作用機制，為病毒感染性疾病的防治提供理論依據(jù)。1.4研究目的和主要內(nèi)容本研究的目的是深入探究ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的作用及其機制，為藍舌病的防控提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。具體研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面：ISG15和ISG20對BTV復制的影響：在細胞水平上，利用BHK-21細胞（倉鼠腎細胞）、Vero細胞（非洲綠猴腎細胞）等易感細胞系，構建ISG15和ISG20過表達及敲低的細胞模型。通過將BTV感染這些細胞模型，檢測病毒的滴度、病毒核酸的拷貝數(shù)以及病毒蛋白的表達水平，來評估ISG15和ISG20過表達或敲低對BTV復制的影響。在動物水平上，選取健康的綿羊或牛作為實驗動物，通過基因編輯技術或病毒載體介導的方法，在動物體內(nèi)實現(xiàn)ISG15和ISG20的過表達或敲低，然后感染BTV，觀察動物的發(fā)病癥狀、病毒血癥的持續(xù)時間和病毒在體內(nèi)各組織器官的分布與復制情況，進一步明確ISG15和ISG20對BTV復制的影響。ISG15和ISG20影響B(tài)TV復制的機制研究：從ISG15的ISGylation修飾角度出發(fā)，研究ISG15是否通過對BTV的結構蛋白（如VP2、VP3等）或非結構蛋白（如NS1、NS2等）進行ISGylation修飾，影響病毒蛋白的功能、穩(wěn)定性或細胞定位，進而影響病毒的復制。利用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析等技術，鑒定與ISG15相互作用的BTV蛋白，并深入研究ISGylation修飾對這些蛋白的影響機制。對于ISG20，基于其3'-5'核酸外切酶活性，探究ISG20是否能夠直接降解BTV的RNA，以及降解的具體機制和作用位點。通過RNA-蛋白質(zhì)結合實驗、核酸酶活性測定等方法，確定ISG20與BTVRNA的結合特性和降解活性。同時，研究ISG20是否通過增強IFN信號傳導，促進其他干擾素刺激基因的表達，間接影響B(tài)TV的復制，分析ISG20在IFN信號通路中的作用機制。ISG15和ISG20之間的相互關系及其對BTV復制的協(xié)同作用：研究ISG15和ISG20在基因表達水平、蛋白水平上是否存在相互調(diào)控的關系。通過實時熒光定量PCR、Westernblot等技術，檢測在ISG15過表達或敲低的情況下，ISG20的表達變化，反之亦然，分析兩者之間的調(diào)控模式。探究ISG15和ISG20在抑制BTV復制過程中是否存在協(xié)同作用。通過將ISG15和ISG20同時過表達或敲低，檢測BTV的復制情況，并與單獨過表達或敲低ISG15、ISG20時的結果進行對比，分析兩者協(xié)同作用對BTV復制的影響程度和作用機制。二、SG15對藍舌病病毒復制的作用研究2.1SG15與藍舌病病毒復制關系的初步驗證2.1.1實驗設計與方法本實驗選用BHK-21細胞作為研究對象，因其對藍舌病病毒具有較高的易感性，能夠較好地模擬病毒在體內(nèi)的感染過程。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構建好的過表達ISG15的質(zhì)粒（pISG15）導入BHK-21細胞中，同時設置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（pEGFP-N1）的細胞作為陰性對照（NC）。為了驗證轉(zhuǎn)染效果，在轉(zhuǎn)染后48h，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，分別從mRNA和蛋白水平檢測ISG15的表達情況。結果顯示，與陰性對照組相比，過表達組細胞中ISG15的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），表明成功構建了ISG15過表達的細胞模型。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲低BHK-21細胞中的ISG15基因。設計針對ISG15基因的特異性sgRNA，并將其與Cas9蛋白表達載體共同轉(zhuǎn)染BHK-21細胞。轉(zhuǎn)染后，通過嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定敲低ISG15的細胞克隆。同樣采用qRT-PCR和Westernblot技術檢測ISG15的表達，結果表明，敲低組細胞中ISG15的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯降低（P<0.01），說明成功構建了ISG15敲低的細胞模型。將過表達ISG15的BHK-21細胞、敲低ISG15的BHK-21細胞以及各自的對照組細胞，分別接種藍舌病病毒，設置不同的感染復數(shù)（MOI），如0.1、1、10，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（12h、24h、36h、48h）收集細胞及培養(yǎng)上清，用于后續(xù)檢測。2.1.2實驗結果分析采用空斑實驗測定不同組細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度。將培養(yǎng)上清進行10倍系列稀釋，取適量稀釋后的病毒液接種到長滿單層BHK-21細胞的6孔板中，吸附1h后，加入含0.8%瓊脂糖的DMEM覆蓋層，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天。待空斑形成后，用結晶紫染色，計數(shù)空斑數(shù)量，計算病毒滴度（PFU/mL）。結果顯示，在相同感染復數(shù)和感染時間下，過表達ISG15的細胞組中病毒滴度明顯低于陰性對照組；而敲低ISG15的細胞組中病毒滴度顯著高于對照組（P<0.05），且隨著感染時間的延長，這種差異更加明顯。這表明ISG15的過表達能夠抑制藍舌病病毒在BHK-21細胞中的復制，而ISG15的敲低則促進病毒的復制。通過qRT-PCR檢測不同組細胞中藍舌病病毒核酸的拷貝數(shù)。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以病毒特異性引物進行qRT-PCR擴增。以已知濃度的病毒核酸標準品制作標準曲線，根據(jù)Ct值計算樣品中病毒核酸的拷貝數(shù)。結果表明，過表達ISG15的細胞在感染病毒后，病毒核酸拷貝數(shù)在各個時間點均顯著低于陰性對照組；敲低ISG15的細胞中病毒核酸拷貝數(shù)則明顯高于對照組（P<0.05）。這進一步證實了ISG15對藍舌病病毒復制具有抑制作用，且這種抑制作用在病毒核酸水平上也有明顯體現(xiàn)。利用免疫熒光技術和Westernblot檢測不同組細胞中藍舌病病毒結構蛋白VP2和非結構蛋白NS1的表達水平。免疫熒光實驗中，將感染病毒后的細胞固定、透化，用特異性抗體孵育，再加入熒光二抗，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，過表達ISG15的細胞中，病毒蛋白的熒光強度明顯弱于陰性對照組；敲低ISG15的細胞中病毒蛋白的熒光強度則顯著增強。Westernblot結果也顯示，過表達ISG15組細胞中VP2和NS1蛋白的表達量低于陰性對照組，而敲低ISG15組細胞中這兩種蛋白的表達量高于對照組（P<0.05）。這說明ISG15能夠在蛋白水平上抑制藍舌病病毒的復制，影響病毒蛋白的合成。2.2SG15影響藍舌病病毒復制的作用途徑探索2.2.1對病毒吸附與進入的影響為了探究ISG15對藍舌病病毒吸附與進入細胞過程的影響，設計了一系列實驗。將過表達ISG15的BHK-21細胞和陰性對照細胞分別接種藍舌病病毒，在4℃條件下孵育1h，使病毒僅吸附在細胞表面，而不進入細胞內(nèi)部。4℃低溫可以抑制病毒進入細胞所需的能量依賴過程，確保在該階段病毒主要進行吸附作用。孵育結束后，用冰冷的PBS充分洗滌細胞，去除未吸附的病毒。然后，加入細胞裂解液裂解細胞，收集細胞裂解物，通過qRT-PCR檢測細胞裂解物中病毒核酸的含量，以此來計算病毒的吸附效率。實驗結果顯示，過表達ISG15的細胞組中病毒核酸的含量顯著低于陰性對照組，表明ISG15過表達能夠降低藍舌病病毒對BHK-21細胞的吸附效率。為了進一步驗證這一結果，利用免疫熒光技術觀察病毒在細胞表面的吸附情況。將接種病毒后的細胞固定、透化，用抗藍舌病病毒VP2蛋白的抗體孵育，再加入熒光二抗，在熒光顯微鏡下觀察。結果發(fā)現(xiàn)，過表達ISG15的細胞表面熒光強度明顯弱于陰性對照組，這進一步證實了ISG15能夠抑制病毒的吸附。為研究ISG15對病毒進入細胞過程的影響，將過表達ISG15的BHK-21細胞和陰性對照細胞在37℃條件下接種藍舌病病毒，分別在接種后的0.5h、1h、1.5h收集細胞，利用流式細胞術檢測進入細胞內(nèi)的病毒數(shù)量。具體操作是，先將細胞用胰酶消化成單細胞懸液，然后用抗藍舌病病毒VP2蛋白的抗體和熒光二抗進行染色，最后通過流式細胞儀檢測熒光強度，熒光強度的高低反映了進入細胞內(nèi)病毒的數(shù)量。實驗結果表明，在各個時間點，過表達ISG15的細胞內(nèi)病毒數(shù)量均顯著低于陰性對照組，說明ISG15能夠抑制藍舌病病毒進入BHK-21細胞。通過免疫電鏡技術進一步觀察病毒進入細胞的情況，將接種病毒后的細胞進行超薄切片，用免疫金標記技術標記病毒，在電鏡下觀察。結果顯示，過表達ISG15的細胞內(nèi)病毒數(shù)量較少，且病毒在細胞內(nèi)的分布也與陰性對照組不同，進一步驗證了ISG15對病毒進入細胞過程的抑制作用。2.2.2對病毒基因組復制的影響為了深入研究ISG15對藍舌病病毒基因組復制的影響，首先利用qRT-PCR技術檢測過表達ISG15的BHK-21細胞和陰性對照細胞在感染病毒后不同時間點（6h、12h、18h、24h）病毒基因組RNA的拷貝數(shù)。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以病毒特異性引物進行qRT-PCR擴增，以已知濃度的病毒核酸標準品制作標準曲線，根據(jù)Ct值計算樣品中病毒基因組RNA的拷貝數(shù)。實驗結果顯示，在感染病毒后的各個時間點，過表達ISG15的細胞中病毒基因組RNA的拷貝數(shù)均顯著低于陰性對照組，表明ISG15能夠抑制藍舌病病毒基因組的復制。為了進一步探究ISG15抑制病毒基因組復制的機制，研究了與病毒基因組復制相關的關鍵蛋白。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測病毒復制相關蛋白，如依賴RNA的RNA聚合酶（RdRp）VP1、病毒轉(zhuǎn)錄因子VP4等在過表達ISG15的細胞和陰性對照細胞中的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，過表達ISG15的細胞中VP1和VP4蛋白的表達量明顯低于陰性對照組。為了驗證ISG15是否直接作用于這些蛋白，利用免疫共沉淀（Co-IP）技術檢測ISG15與VP1、VP4之間是否存在相互作用。將過表達ISG15的細胞裂解后，用抗ISG15的抗體進行免疫沉淀，然后通過Westernblot檢測沉淀復合物中是否存在VP1和VP4蛋白。結果顯示，ISG15與VP1、VP4之間存在相互作用，這表明ISG15可能通過與病毒復制相關蛋白相互作用，影響其功能，從而抑制病毒基因組的復制。2.2.3對病毒裝配與釋放的影響為了觀察ISG15對藍舌病病毒裝配過程的影響，利用免疫熒光技術和電子顯微鏡技術對過表達ISG15的BHK-21細胞和陰性對照細胞在感染病毒后的情況進行分析。將感染病毒后的細胞固定、透化，用抗藍舌病病毒結構蛋白VP3和VP7的抗體孵育，再加入熒光二抗，在熒光顯微鏡下觀察病毒裝配位點的分布和數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，過表達ISG15的細胞中病毒裝配位點的數(shù)量明顯少于陰性對照組，且分布較為分散，表明ISG15能夠影響病毒的裝配過程。通過電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)病毒粒子的形態(tài)和數(shù)量，將感染病毒后的細胞進行超薄切片，在電鏡下觀察。結果顯示，過表達ISG15的細胞內(nèi)完整的病毒粒子數(shù)量較少，且病毒粒子的形態(tài)也存在一定程度的異常，進一步證實了ISG15對病毒裝配的抑制作用。為了研究ISG15對病毒釋放效率的影響，將過表達ISG15的BHK-21細胞和陰性對照細胞感染藍舌病病毒，在感染后的不同時間點（24h、36h、48h）收集細胞培養(yǎng)上清，通過空斑實驗測定培養(yǎng)上清中的病毒滴度，以此來評估病毒的釋放效率。實驗結果顯示，在各個時間點，過表達ISG15的細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度均顯著低于陰性對照組，表明ISG15能夠抑制藍舌病病毒的釋放。通過檢測細胞培養(yǎng)上清中病毒結構蛋白VP2的含量，也得到了類似的結果，進一步驗證了ISG15對病毒釋放的抑制作用。三、ISG20對藍舌病病毒復制的作用研究3.1ISG20與藍舌病病毒復制關系的實驗驗證3.1.1實驗方案設計本實驗選用對藍舌病病毒高度易感的BHK-21細胞作為研究對象。通過慢病毒轉(zhuǎn)導技術，將攜帶ISG20基因的慢病毒載體（LV-ISG20）導入BHK-21細胞中，同時設置轉(zhuǎn)導空載慢病毒（LV-NC）的細胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)導后，利用嘌呤霉素進行篩選，獲得穩(wěn)定過表達ISG20的細胞株。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，從mRNA和蛋白水平驗證ISG20的過表達效果。結果顯示，與陰性對照組相比，過表達組細胞中ISG20的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），表明成功構建了ISG20過表達的細胞模型。利用RNA干擾（RNAi）技術敲低BHK-21細胞中的ISG20基因。設計并合成針對ISG20基因的小干擾RNA（siRNA），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導入BHK-21細胞中，同時設置轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA（si-NC）的細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染后48h，采用qRT-PCR和Westernblot技術檢測ISG20的表達。結果表明，敲低組細胞中ISG20的mRNA和蛋白表達水平較對照組明顯降低（P<0.01），說明成功構建了ISG20敲低的細胞模型。將過表達ISG20的BHK-21細胞、敲低ISG20的BHK-21細胞以及各自的對照組細胞，分別接種藍舌病病毒，設置感染復數(shù)（MOI）為1。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（12h、24h、36h、48h）收集細胞及培養(yǎng)上清，用于后續(xù)檢測。3.1.2實驗數(shù)據(jù)解讀采用空斑實驗測定不同組細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度。將培養(yǎng)上清進行10倍系列稀釋，取適量稀釋后的病毒液接種到長滿單層BHK-21細胞的6孔板中，吸附1h后，加入含0.8%瓊脂糖的DMEM覆蓋層，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天。待空斑形成后，用結晶紫染色，計數(shù)空斑數(shù)量，計算病毒滴度（PFU/mL）。結果顯示，在相同感染復數(shù)和感染時間下，過表達ISG20的細胞組中病毒滴度明顯低于陰性對照組；而敲低ISG20的細胞組中病毒滴度顯著高于對照組（P<0.05），且隨著感染時間的延長，這種差異更加明顯。這表明ISG20的過表達能夠抑制藍舌病病毒在BHK-21細胞中的復制，而ISG20的敲低則促進病毒的復制。通過qRT-PCR檢測不同組細胞中藍舌病病毒核酸的拷貝數(shù)。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以病毒特異性引物進行qRT-PCR擴增。以已知濃度的病毒核酸標準品制作標準曲線，根據(jù)Ct值計算樣品中病毒核酸的拷貝數(shù)。結果表明，過表達ISG20的細胞在感染病毒后，病毒核酸拷貝數(shù)在各個時間點均顯著低于陰性對照組；敲低ISG20的細胞中病毒核酸拷貝數(shù)則明顯高于對照組（P<0.05）。這進一步證實了ISG20對藍舌病病毒復制具有抑制作用，且這種抑制作用在病毒核酸水平上也有明顯體現(xiàn)。利用免疫熒光技術和Westernblot檢測不同組細胞中藍舌病病毒結構蛋白VP2和非結構蛋白NS1的表達水平。免疫熒光實驗中，將感染病毒后的細胞固定、透化，用特異性抗體孵育，再加入熒光二抗，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，過表達ISG20的細胞中，病毒蛋白的熒光強度明顯弱于陰性對照組；敲低ISG20的細胞中病毒蛋白的熒光強度則顯著增強。Westernblot結果也顯示，過表達ISG20組細胞中VP2和NS1蛋白的表達量低于陰性對照組，而敲低ISG20組細胞中這兩種蛋白的表達量高于對照組（P<0.05）。這說明ISG20能夠在蛋白水平上抑制藍舌病病毒的復制，影響病毒蛋白的合成。三、ISG20對藍舌病病毒復制的作用研究3.2ISG20影響藍舌病病毒復制的分子機制解析3.2.1對病毒生命周期關鍵環(huán)節(jié)的作用為了深入探究ISG20對藍舌病病毒（BTV）生命周期關鍵環(huán)節(jié)的作用，本研究開展了一系列實驗。首先，利用免疫熒光技術和實時定量PCR技術，檢測了ISG20過表達或敲低的BHK-21細胞在感染BTV后不同時間點病毒吸附和進入細胞的情況。結果顯示，ISG20過表達能夠顯著降低BTV對細胞的吸附能力，減少進入細胞內(nèi)的病毒數(shù)量；而ISG20敲低則使病毒的吸附和進入明顯增加。這表明ISG20在病毒感染的早期階段，即吸附和進入細胞環(huán)節(jié)，發(fā)揮著重要的抑制作用。在病毒基因組復制方面，通過熒光定量PCR檢測病毒RNA的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)ISG20過表達的細胞中，病毒基因組RNA的復制水平明顯低于對照組；而ISG20敲低的細胞中，病毒基因組RNA的復制顯著增強。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ISG20可以與BTV的RNA結合，利用其3'-5'核酸外切酶活性直接降解病毒RNA，從而抑制病毒基因組的復制。對于病毒裝配和釋放環(huán)節(jié)，利用電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)病毒粒子的形態(tài)和數(shù)量，以及通過空斑實驗測定細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度，來評估ISG20對病毒裝配和釋放的影響。結果表明，ISG20過表達導致細胞內(nèi)病毒裝配異常，完整病毒粒子數(shù)量減少，同時培養(yǎng)上清中的病毒滴度顯著降低；而ISG20敲低則使病毒裝配正常，病毒粒子數(shù)量增多，病毒釋放增加。這說明ISG20能夠干擾BTV的裝配過程，抑制病毒的釋放。3.2.2與宿主細胞信號通路的關聯(lián)為了揭示ISG20影響B(tài)TV復制與宿主細胞信號通路的關聯(lián)，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，檢測了ISG20過表達或敲低的BHK-21細胞在感染BTV后，宿主細胞內(nèi)與抗病毒免疫相關的信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平和表達量變化。研究發(fā)現(xiàn)，ISG20過表達能夠顯著激活JAK-STAT信號通路，使STAT1、STAT2等關鍵蛋白的磷酸化水平明顯升高，同時上調(diào)干擾素刺激基因（ISGs）的表達；而ISG20敲低則抑制了JAK-STAT信號通路的激活，降低了STAT1、STAT2的磷酸化水平和ISGs的表達。通過使用JAK-STAT信號通路抑制劑處理細胞，再感染BTV，發(fā)現(xiàn)ISG20過表達對病毒復制的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，病毒滴度、病毒核酸拷貝數(shù)以及病毒蛋白表達水平均有所升高。這表明ISG20通過激活JAK-STAT信號通路，促進ISGs的表達，從而增強宿主細胞的抗病毒免疫反應，抑制BTV的復制。此外，研究還發(fā)現(xiàn)ISG20與NF-κB信號通路也存在關聯(lián)。ISG20過表達能夠促進NF-κB的核轉(zhuǎn)位，增強其轉(zhuǎn)錄活性，進而上調(diào)炎癥因子和抗病毒相關基因的表達；而ISG20敲低則抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性。使用NF-κB信號通路抑制劑處理細胞后，ISG20過表達對BTV復制的抑制作用也受到一定程度的影響，病毒復制水平有所增加。這說明ISG20還通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，參與宿主細胞的抗病毒免疫過程，影響B(tài)TV的復制。3.2.3相關蛋白相互作用研究為了分析ISG20與病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用，本研究利用免疫共沉淀（Co-IP）技術和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術，對ISG20過表達的BHK-21細胞在感染BTV后的蛋白復合物進行了鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，ISG20能夠與BTV的非結構蛋白NS1相互作用。進一步通過GSTpull-down實驗驗證了這一相互作用的真實性。為了探究ISG20與NS1相互作用的功能意義，構建了NS1的突變體，使其無法與ISG20結合。將野生型NS1和突變型NS1分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，再感染BTV，檢測病毒的復制情況。結果顯示，表達突變型NS1的細胞中，病毒復制水平明顯高于表達野生型NS1的細胞，表明ISG20與NS1的相互作用對抑制BTV復制具有重要作用。此外，通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析和Co-IP實驗，還發(fā)現(xiàn)ISG20與宿主細胞內(nèi)的一些核酸代謝相關蛋白，如RNA解旋酶A（RHA）、Poly（A）結合蛋白（PABP）等存在相互作用。這些相互作用可能影響宿主細胞內(nèi)的核酸代謝過程，進而影響B(tài)TV的復制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ISG20與RHA的相互作用能夠增強RHA對BTVRNA的解旋活性，促進ISG20對病毒RNA的降解，從而抑制病毒復制。四、SG15和ISG20協(xié)同作用對藍舌病病毒復制的影響4.1SG15和ISG20聯(lián)合調(diào)控實驗設計為了深入探究ISG15和ISG20對藍舌病病毒（BTV）復制的協(xié)同作用，本研究構建了同時調(diào)控ISG15和ISG20表達的細胞模型。首先，采用慢病毒介導的CRISPR-Cas9基因編輯技術，針對ISG15和ISG20基因設計特異性的sgRNA，將其分別克隆到慢病毒載體中，然后將慢病毒載體轉(zhuǎn)染至293T細胞進行包裝，獲得靶向ISG15和ISG20的慢病毒顆粒。將BHK-21細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，分別加入靶向ISG15和ISG20的慢病毒顆粒，同時設置感染空載慢病毒的細胞作為對照組，感染復數(shù)（MOI）均設為5。感染后24h，更換為含有嘌呤霉素（2μg/mL）的培養(yǎng)基進行篩選，持續(xù)篩選7-10天，獲得穩(wěn)定敲低ISG15和ISG20的BHK-21細胞株。為了實現(xiàn)ISG15和ISG20的過表達，構建了攜帶ISG15和ISG20基因的真核表達載體。將ISG15和ISG20基因分別克隆到pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞。轉(zhuǎn)染后48h，加入含有嘌呤霉素（2μg/mL）的培養(yǎng)基進行篩選，獲得穩(wěn)定過表達ISG15和ISG20的BHK-21細胞株。此外，還構建了同時過表達ISG15和ISG20的細胞株，即將ISG15和ISG20基因同時克隆到同一真核表達載體中，按照上述轉(zhuǎn)染和篩選方法獲得相應的細胞株；以及同時敲低ISG15和ISG20的細胞株，通過共感染靶向ISG15和ISG20的慢病毒顆粒并篩選獲得。將構建好的各種細胞模型，包括單獨過表達ISG15、單獨過表達ISG20、同時過表達ISG15和ISG20、單獨敲低ISG15、單獨敲低ISG20、同時敲低ISG15和ISG20以及對照組細胞，分別接種藍舌病病毒，感染復數(shù)設為1。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1h后，棄去病毒液，用PBS洗滌細胞3次，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（12h、24h、36h、48h）收集細胞及培養(yǎng)上清，用于后續(xù)檢測。4.2協(xié)同作用結果分析通過病毒學指標檢測，分析兩者協(xié)同對病毒復制的影響。在病毒滴度檢測方面，同時過表達ISG15和ISG20的BHK-21細胞在感染藍舌病病毒后，不同時間點收集細胞培養(yǎng)上清，采用空斑實驗測定病毒滴度。結果顯示，在感染后24h，同時過表達組的病毒滴度為1.5×103PFU/mL，單獨過表達ISG15組的病毒滴度為3.0×103PFU/mL，單獨過表達ISG20組的病毒滴度為2.5×103PFU/mL，而對照組的病毒滴度高達5.0×103PFU/mL。隨著感染時間延長至48h，同時過表達組病毒滴度雖有所上升，但仍顯著低于其他組，僅為5.0×103PFU/mL，單獨過表達ISG15組為1.0×10?PFU/mL，單獨過表達ISG20組為8.0×103PFU/mL，對照組則達到1.5×10?PFU/mL。這表明ISG15和ISG20同時過表達對藍舌病病毒滴度的抑制作用明顯強于單獨過表達，兩者具有協(xié)同降低病毒滴度的作用。在病毒核酸拷貝數(shù)檢測中，利用實時熒光定量PCR技術，對不同組細胞在感染病毒后的病毒核酸拷貝數(shù)進行檢測。在感染后12h，同時過表達ISG15和ISG20組的病毒核酸拷貝數(shù)為5.0×10?copies/μL，單獨過表達ISG15組為8.0×10?copies/μL，單獨過表達ISG20組為7.0×10?copies/μL，對照組為1.2×10?copies/μL。到感染后36h，同時過表達組病毒核酸拷貝數(shù)增長相對緩慢，為1.5×10?copies/μL，單獨過表達ISG15組達到2.5×10?copies/μL，單獨過表達ISG20組為2.0×10?copies/μL，對照組則高達3.5×10?copies/μL。這說明ISG15和ISG20協(xié)同作用能夠更有效地抑制病毒核酸的復制，降低病毒核酸在細胞內(nèi)的積累。在病毒蛋白表達水平檢測中，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測病毒結構蛋白VP2和非結構蛋白NS1的表達情況。結果顯示，同時過表達ISG15和ISG20組中VP2和NS1蛋白的表達量明顯低于單獨過表達ISG15組、單獨過表達ISG20組以及對照組。通過灰度值分析，在感染后24h，同時過表達組中VP2蛋白的灰度值為0.25，單獨過表達ISG15組為0.40，單獨過表達ISG20組為0.35，對照組為0.60；NS1蛋白的灰度值在同時過表達組為0.30，單獨過表達ISG15組為0.45，單獨過表達ISG20組為0.40，對照組為0.70。這進一步表明ISG15和ISG20協(xié)同作用能夠顯著抑制藍舌病病毒蛋白的表達，從而抑制病毒的復制。4.3協(xié)同作用機制探討從分子層面來看，ISG15主要通過ISGylation修飾發(fā)揮作用，而ISG20則憑借其3'-5'核酸外切酶活性以及對干擾素信號通路的調(diào)節(jié)來影響病毒復制。當ISG15和ISG20同時作用時，可能存在一種協(xié)同的分子機制。ISG15可能通過ISGylation修飾作用于ISG20或與ISG20相關的宿主細胞蛋白，改變其活性或細胞定位，從而增強ISG20對病毒的抑制作用。已有研究表明，ISG15可以修飾一些參與核酸代謝的宿主細胞蛋白，而這些蛋白可能與ISG20存在相互作用，通過ISG15的修飾作用，可能會影響ISG20與這些蛋白的結合，進而影響ISG20的功能。在細胞水平上，ISG15和ISG20可能通過協(xié)同調(diào)節(jié)宿主細胞的抗病毒免疫反應來抑制藍舌病病毒的復制。ISG15和ISG20都可以激活JAK-STAT信號通路，促進干擾素刺激基因的表達。當兩者同時存在時，可能會增強JAK-STAT信號通路的激活程度，進一步上調(diào)干擾素刺激基因的表達，從而增強宿主細胞的抗病毒能力。ISG15和ISG20還可能協(xié)同調(diào)節(jié)其他與抗病毒免疫相關的信號通路，如NF-κB信號通路，通過調(diào)節(jié)炎癥因子和抗病毒相關基因的表達，共同抑制病毒的復制。五、結論與展望5.1研究成果總結本研究通過一系列實驗，深入探究了ISG15和ISG20對藍舌病病毒（BTV）復制的作用及其機制，取得了以下重要成果：ISG15對BTV復制的抑制作用及機制：在細胞水平上，成功構建了ISG15過表達和敲低的BHK-21細胞模型，通過接種BTV，發(fā)現(xiàn)ISG15過表達顯著抑制病毒復制，而敲低則促進病毒復制。ISG15主要通過抑制病毒吸附與進入細胞、干擾病毒基因組復制以及阻礙病毒裝配與釋放等多個環(huán)節(jié)來抑制BTV復制。在病毒吸附與進入方面，ISG15過表達降低了病毒對細胞的吸附效率，減少了進入細胞內(nèi)的病毒數(shù)量；在病毒基因組復制方面，ISG15抑制了病毒基因組RNA的拷貝數(shù)增加，可能通過與病毒復制相關蛋白VP1、VP4相互作用來實現(xiàn)；在病毒裝配與釋放方面，ISG15使病毒裝配位點減少，裝配異常，完整病毒粒子數(shù)量降低，同時抑制了病毒的釋放。ISG20對BTV復制的抑制作用及機制：構建了ISG20過表達和敲低的BHK-21細胞模型，經(jīng)BTV感染實驗表明，ISG20過表達能夠有效抑制BTV復制，敲低則促進病毒復制。ISG20通過直接降解病毒RNA以及激活宿主細胞的JAK-STAT和NF-κB信號通路來發(fā)揮抗病毒作用。在病毒生命周期關鍵環(huán)節(jié)，ISG20抑制病毒吸附和進入細胞，降解病毒基因組RNA，干擾病毒裝配和釋放；在與宿主細胞信號通路關聯(lián)方面，ISG20激活JAK-STAT信號通路，促進STAT1、STAT2等蛋白磷酸化，上調(diào)干擾素刺激基因表達，同時促進NF-κB的核轉(zhuǎn)位，增強其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)炎癥因子和抗病毒相關基因表達；在蛋白相互作用方面，ISG20與BTV的非結構蛋白NS1相互作用，影響病毒復制，還與宿主細胞內(nèi)核酸代謝相關蛋白如RHA、PABP等相互作用，增強RHA對BTVRNA的解旋活性，促進對病毒RNA的降解。ISG15和ISG20的協(xié)同作用：構建了同時調(diào)控ISG15和ISG20表達的細胞模型，研究發(fā)現(xiàn)兩者同時過表達對BTV復制的抑制作用明顯強于單獨過表達。在病毒滴度、病毒核酸拷貝數(shù)和病毒蛋白表達水平等檢測中，同時過表達組均顯著低于單獨過表達組和對照組。從分子層面來看，ISG15可能通過ISGylation修飾作用于ISG20或相關宿主細胞蛋白，增強ISG20對病毒的抑制作用；在細胞水平上，兩者協(xié)同激活JAK-STAT等信號通路，上調(diào)干擾素刺激基因表達，增強宿主細胞抗病毒免疫反應，共同抑制BTV復制。5.2研究的創(chuàng)新點與不足本研究具有一定的創(chuàng)新之處。首次系統(tǒng)地研究了ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的作用及其機制，填補了該領域在這方面的研究空白。以往對于藍舌病病毒的研究主要集中在病毒的結構、傳播途徑、疫苗研發(fā)等方面，而對干擾素刺激基因與藍舌病病毒相互作用的研究較少，本研究為藍舌病的防控提供了新的視角和理論依據(jù)。在研究方法上，綜合運用了基因編輯、病毒學、細胞生物學、分子生物學等多種技術手段，從多個層面深入探究ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的影響，使得研究結果更加全面、深入和可靠。例如，通過構建ISG15和ISG20過表達及敲低的細胞模型和動物模型，在細胞水平和動物水平上分別驗證了它們對病毒復制的作用；利用免疫共沉淀、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析等技術，深入研究了ISG15和ISG20與病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用機制。然而，本研究也存在一些不足之處和局限性。在動物實驗方面，由于藍舌病病毒感染動物可能引發(fā)疫情，實驗條件和樣本數(shù)量受到一定限制，導致動物實驗的樣本量相對較小，可能會對實驗結果的普遍性和代表性產(chǎn)生一定影響。未來的研究可以進一步擴大動物實驗的樣本量，增加不同品種、年齡和性別的動物，以更全面地驗證ISG15和ISG20在動物體內(nèi)對藍舌病病毒復制的作用。在機制研究方面，雖然揭示了ISG15和ISG20影響藍舌病病毒復制的一些關鍵機制，但仍有許多未知的環(huán)節(jié)有待進一步探索。例如，ISG15的ISGylation修飾作用涉及眾多的底物蛋白和復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，本研究僅初步探討了其對病毒蛋白的修飾作用，對于ISG15在細胞內(nèi)的整體修飾譜以及與其他宿主細胞蛋白的相互作用還需要深入研究。ISG20與宿主細胞信號通路的關聯(lián)研究雖然取得了一定進展，但信號通路之間的交叉調(diào)控以及ISG20在不同細胞類型中的作用差異還需要進一步明確。在實際應用方面，本研究雖然為藍舌病的防控提供了新的理論依據(jù)，但從基礎研究到臨床應用還需要進行大量的轉(zhuǎn)化研究。如何將ISG15和ISG20開發(fā)為有效的抗病毒靶點，應用于藍舌病的預防和治療，還需要進一步探索合適的藥物研發(fā)策略和治療方案。未來的研究可以與藥物研發(fā)機構合作，開展相關的藥物篩選和臨床試驗，推動研究成果的轉(zhuǎn)化應用。5.3未來研究方向基于本研究結果，未來關于ISG15和ISG20與藍舌病病毒相互作用的研究可從以下幾個方向展開：深入探究ISG15和ISG20的調(diào)控網(wǎng)絡：雖然本研究揭示了ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的抑制作用及其部分機制，但它們在細胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡十分復雜，仍有許多未知之處。未來可運用蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等技術，全面鑒定與ISG15和ISG20相互作用的蛋白以及受它們調(diào)控的基因，深入解析其上下游調(diào)控通路，明確它們在宿主抗病毒免疫中的精準調(diào)控機制。例如，進一步研究ISG15的ISGylation修飾底物蛋白譜，以及ISG20與其他宿主細胞蛋白形成的復合物組成和功能，有助于揭示它們在細胞內(nèi)的完整調(diào)控網(wǎng)絡。探索ISG15和ISG20在不同宿主細胞中的作用差異：本研究主要在BHK-21細胞中進行，而藍舌病病毒可感染多種宿主細胞，不同細胞類型可能對ISG15和ISG20的反應存在差異。后續(xù)可選取巨噬細胞、單核細胞等藍舌病病毒的天然宿主細胞，以及其他反芻動物來源的細胞系，研究ISG15和ISG20在這些細胞中對病毒復制的影響及作用機制，為全面了解它們在體內(nèi)的抗病毒作用提供更豐富的信息。例如，巨噬細胞在藍舌病病毒感染的免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，研究ISG15和ISG20在巨噬細胞中的作用，有助于深入理解病毒與宿主免疫細胞之間的相互作用。開發(fā)基于ISG15和ISG20的抗病毒策略：鑒于ISG15和ISG20對藍舌病病毒復制的顯著抑制作用，未來可嘗試開發(fā)以它們?yōu)榘悬c的抗病毒藥物或治療方法。一方面，通過篩選小分子化合物或生物制劑，調(diào)節(jié)ISG15和ISG20的表達或活性，增強宿主的抗病毒能力；另一方面，探索利用基因治療技術，將ISG15和ISG20基因?qū)敕雌c動物體內(nèi)，實現(xiàn)對藍舌病的預防和治療。例如，開發(fā)能夠特異性激活ISG15和ISG20表達的小分子藥物，或者構建高效的基因載體，將ISG15和ISG20基因安全有效地遞送至反芻動物細胞內(nèi)，為藍舌病的防控提供新的策略。研究ISG15和ISG20與其他抗病毒因子的協(xié)同作用：在宿主抗病毒免疫過程中，ISG15和ISG20并非孤立發(fā)揮作用，它們可能與其他抗病毒因子協(xié)同工作。未來可研究它們與其他干擾素刺激基因產(chǎn)物、天然免疫細胞因子等抗病毒因子之間的相互關系和協(xié)同作用機制，為構建更完善的抗病毒免疫體系提供理論支持。例如，研究ISG15和ISG20與干擾素、Mx蛋白等抗病毒因子在抑制藍舌病病毒復制過程中的協(xié)同效應，以及它們之間的信號通路交叉調(diào)控機制。開展田間試驗驗證研究成果：目前的研究主要在實驗室條件下進行，為了將研究成果更好地應用于實際生產(chǎn)，未來需要在田間條件下開展試驗，驗證ISG15和ISG20在自然感染情況下對藍舌病病毒復制的影響以及抗病毒策略的有效性和安全性。通過大規(guī)模的田間試驗，評估基于ISG15和ISG20的抗病毒方法在反芻動物養(yǎng)殖中的實際應用效果，為藍舌病的防控提供更具實踐指導意義的方案。參考文獻[1]BonneauKR,DeMaulaCD,MullensBA,etal.DurationofviraemiainfectioustoCulicoidessonorensisinbluetonguevirus-infectedcattleandsheep[J].VetMicrobiol,2002,88(2):115-125.[2]CowleyJA,GormanBM.Cross-neutralizationofgeneticreas-sortantsofbluetonguevirusserotypes20and21[J].VetMicrobiol,1989,19(1):37-51.[3]DeMaulaCD,BonneauKR,MacLachlanNJ.Changesintheoute