課時規范練60基因工程的基本工具與操作程序(選擇題每小題3分)必備知識基礎練考點一重組DNA技術的基本工具1.(2025·山西呂梁開學模擬)DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶。下列相關敘述正確的是()A.所有的限制酶都具有專一性,不同限制酶切割產生的黏性末端都不同B.限制酶和DNA連接酶分別能催化磷酸二酯鍵的斷裂和形成C.限制酶識別序列越短,則相應酶切位點在DNA中出現的概率越小D.DNA連接酶可以將游離的單個脫氧核苷酸連接成雙鏈結構2.(2025·四川綿陽模擬)下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息,將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是()pBR322質粒人生長激素基因注:AmpR:氨芐青霉素抗性基因;TetR:四環素抗性基因。A.用含氨芐青霉素的培養基篩選出的是含重組質粒的受體菌B.應選擇的限制酶組合是酶F和酶GC.pBR322質粒含有的AmpR基因和TetR基因都屬于標記基因D.同時用三種限制酶處理圖中質粒,完全反應后可得到4種長度DNA3.(2025·北京西城開學模擬)用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性內切核酸酶分別處理同一DNA片段,酶切位點及酶切產物分離結果如圖。以下敘述不正確的是()圖1酶切位點圖圖2電泳結果示意圖A.圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同B.圖2中酶切產物可用于構建重組DNAC.泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產物D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA4.(2023·湖北卷)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒,構建基因表達載體(重組質粒),并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是()A.若用HindⅢ酶切,目的基因轉錄的產物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四環素)培養基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D.若用SphⅠ酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet(四環素)的培養基中能形成菌落考點二基因工程的基本操作程序5.(2025·甘肅白銀模擬)釀酒酵母耐酸能力較強,但不產生乳酸。研究者將乳酸菌內催化乳酸生成的乳酸脫氫酶(LDH)基因導入釀酒酵母,獲得能產生乳酸的酵母工程菌株。下圖為乳酸脫氫酶基因對應的DNA片段結構示意圖,其中1~4表示DNA上引物可能結合的位置。下列分析錯誤的是()A.構建基因表達載體時,需用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶B.若從圖中的DNA片段中直接獲取LDH基因,則被破壞的磷酸二酯鍵共有4個C.用PCR技術擴增LDH基因時,變性后需要先升溫后降溫D.用PCR技術擴增LDH基因時,圖中的2、3分別是兩種引物結合的位置6.(2025·云南文山模擬)除草劑的有效成分草甘膦能夠專一性抑制EPSP合成酶的作用,從而使植物多種代謝途徑受影響而導致植物死亡,草甘膦沒有選擇性,除掉雜草的同時作物也會受損,培育抗草甘膦作物是解決辦法之一,下列關于轉入外源EPSP合成酶基因使矮牽牛抗草甘膦流程的敘述正確的是()A.可以通過mRNA在逆轉錄酶的作用下構建DNA,從而獲取EPSP合成酶基因B.用限制酶和DNA連接酶處理目的基因和Ti質粒,僅涉及磷酸二酯鍵的斷裂和形成C.基因表達載體組件中的起始密碼子是RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動基因轉錄D.目的基因插入Ti質粒的T-DNA上,農桿菌的轉化能使植物細胞都培育出轉基因植株7.(2024·福建龍巖模擬)為提高紅豆杉細胞培養物中紫杉醇的產量,研究人員構建紫杉醇合成關鍵酶基因(Bapt)的超表達載體,并將其導入紅豆杉細胞,具體流程如下圖。下列相關說法錯誤的是()A.p1301載體上應含有增強Bapt基因表達的序列B.超表達載體中應含有潮霉素抗性基因作為標記基因C.可使用Bapt基因制成的探針檢測過程⑤是否成功D.工廠化生產紫杉醇需將改造后的紅豆杉細胞培養至愈傷組織8.(2025·云南昆明模擬)Ca2+在多項生物技術與工程中發揮重要作用,下列說法錯誤的是()A.Ca2+載體等可激活通過核移植得到的重構胚,促進其細胞分裂和發育進程B.Ca2+處理可以使大腸桿菌細胞處于能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態C.真核細胞和細菌的DNA聚合酶需要Ca2+激活,故PCR反應緩沖液中需要添加該離子D.在植物體細胞雜交過程中,可用高Ca2+—高pH融合法誘導原生質體的融合9.(12分)(2024·甘肅卷)源于細菌的纖維素酶是一種復合酶,能降解纖維素。為了提高纖維素酶的降解效率,某課題組通過篩選高產纖維素酶菌株,克隆表達降解纖維素的三種酶(如下圖),研究了三種酶混合的協同降解作用,以提高生物質資源的利用效率。回答下列問題。(1)過程①②采用以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養基篩選菌株X,能起到篩選作用的原因是。高產纖維素酶菌株篩選時,剛果紅培養基上的菌落周圍透明圈大小反映了。

(2)過程④擴增不同目的基因片段需要的關鍵酶是。

(3)過程⑤在基因工程中稱為,該過程需要的主要酶有。

(4)過程⑥大腸桿菌作為受體細胞的優點有。該過程用Ca2+處理細胞,使其處于一種的生理狀態。

(5)課題組用三種酶及酶混合物對不同生物質原料進行降解處理,結果如下表。表中協同系數存在差異的原因是

(答出兩點)。

生物質原料降解率/%協同系數酶A酶B酶C混1混2混1混2小麥秸稈7.086.038.198.6126.9874.33114.64玉米秸稈2.621.483.763.929.8824.9877.02玉米芯0.620.480.860.986.791.8211.34注:混1和混2表示三種酶的混合物。10.(13分)(2025·湖南名校第一次聯考)紫色花青素是一種天然色素,廣泛存在于多種植物中,尤其是在花朵、果實和葉子中。紫色花青素能夠清除自由基,有助于保護視網膜,還有抑制癌細胞生長的潛力等。紫色西紅柿經基因編輯后可產生比普通西紅柿多9倍的花青素(紫色),下圖是花青素基因(S)的cDNA(某種生物發育某個時期的mRNA經逆轉錄產生的互補DNA)和Ti質粒圖。回答下列問題。(1)紫色花青素能夠清除自由基,保護細胞免受氧化損傷。自由基損害細胞主要表現為

(答2點)。紫色花青素處理癌細胞可使其細胞周期(填“縮短”“延長”或“不變”)。

(2)構建基因表達載體時,最好選擇限制酶切割S基因的cDNA和Ti質粒,以保證目的基因與載體定向連接,從而提高重組效率。利用PCR技術擴增花青素基因的cDNA時,需要種引物,一般還需要往PCR反應緩沖液中加入Mg2+,其原因是。PCR擴增的產物進行電泳時,發現除了目標序列外還有很多非特異性條帶,出現該現象的原因可能有(答2點)。

(3)基因編輯作物的安全性和監管是一個重要議題。在研發過程中,需要確保紫色西紅柿的安全性。紫色花青素的合成途徑涉及多個基因,其中包括轉錄因子,這些轉錄因子可以激活或抑制紫色花青素合成相關基因的表達。增加紫色花青素的產量的措施有

(答1點)。

考點三實驗:DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定11.(2024·安徽卷)下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述,錯誤的是()A.實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水,DNA提取的效率會降低B.利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異,可初步分離DNAC.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同,該原理可用于純化DNA粗提物D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應,可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質12.(2025·山東臨沂開學模擬)下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述,正確的是()A.粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中,加入二苯胺試劑后即顯藍色B.選用花菜、香蕉等植物細胞提取DNA時,應該先用洗滌劑溶解細胞壁C.向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNAD.析出DNA時,玻璃棒來回向不同方向攪拌可快速獲得DNA13.(不定項)(2025·江蘇開學模擬)利用PCR擴增下面DNA分子,下列敘述正確的是()A.其中一種引物的部分堿基序列應為3'-ATTTGAAGTCCCA-5'B.變性時,在高溫的作用下雙鏈DNA解聚為單鏈DNAC.復制n輪后,同時含有兩種引物的子代DNA分子有2n-2個D.復性時,溫度過高會導致PCR擴增出多種DNA片段關鍵能力提升練14.(2025·八省聯考云南卷)Hv-Lv肽鏈是抗體與抗原識別并結合的關鍵結構。為篩選特異性高、結合能力強的Hv-Lv肽鏈,將編碼Hv-Lv肽鏈的DNA片段與絲狀噬菌體固有外殼蛋白pⅧ的基因連接并一起表達,最后用固定化抗原篩選(過程如圖)。下列說法錯誤的是()A.Hv-LvDNA片段上游需要設計并連接啟動子B.Hv-LvDNA片段上無需連接標記基因C.目標是獲得能耐受多次沖洗的噬菌體D.實驗過程須嚴格遵循生物防護措施15.(2024·四川眉山期中)下圖為構建苘麻抗除草劑基因A重組質粒的技術流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因僅在真核細胞中表達,表達產物可催化底物呈藍色。下列說法錯誤的是()A.PCR擴增A時可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位點B.在培養基中添加卡那霉素初步篩選導入重組質粒的農桿菌C.用農桿菌轉化植物愈傷組織時選擇呈現藍色的農桿菌與植物進行培養D.啟動子若為除草劑誘導啟動子將減少細胞物質和能量浪費16.(8分)(2024·全國新課標卷)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細菌(B1)的基因組中,構建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質粒中插入B1基因組的M1與M2片段;再經限制酶切割獲得含N基因的片段甲,片段甲兩端分別為M1與M2;利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術將片段甲插入B1的基因組,得到菌株B2。酶切位點(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的結合位置、片段甲替換區如圖所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列問題。(1)限制酶切割的化學鍵是。為保證N基因能在菌株B2中表達,在構建片段甲時,應將M1與M2片段分別插入質粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間,原因是。

(2)CRISPR/Cas9技術可以切割細菌B1基因組中與向導RNA結合的DNA。向導RNA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G—C和。

(3)用引物P1和P2進行PCR可驗證片段甲插入了細菌B1基因組,所用的模板是;若用該模板與引物P3和P4進行PCR,實驗結果是。

(4)與秸稈焚燒相比,利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優點是(答出2點即可)。

參考答案課時規范練60基因工程的基本工具與操作程序必備知識基礎練1.B解析所有的限制酶都具有專一性,不同限制酶切割產生的黏性末端可能相同,A項錯誤;限制酶能夠識別特定的DNA序列并催化磷酸二酯鍵的斷裂,而DNA連接酶能夠催化磷酸二酯鍵的形成,將DNA片段連接起來,B項正確;限制酶識別序列越短,則相應酶切位點在DNA中出現的概率越大,因為短序列在DNA中出現的頻率較高,C項錯誤;DNA連接酶的功能是將DNA片段連接起來,而不是將游離的單個脫氧核苷酸連接成雙鏈結構,D項錯誤。2.A解析酶E會破壞兩種標記基因,為避免切割后DNA片段的自身環化,又保留質粒上的標記基因,切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G,由于酶F會破壞四環素抗性基因,故使用含氨芐青霉素的培養基篩選出的是導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體菌,A項錯誤,B項正確;pBR322質粒含有的AmpR基因和TetR基因都屬于標記基因,以便于對含有目的基因的受體菌進行選擇,C項正確;據圖可知,同時用三種限制酶處理圖中質粒,因酶E有兩個作用位點,故同時用三種限制酶處理圖中質粒,完全反應后可得到4種長度DNA,D項正確。3.D解析酶具有專一性,不同的限制酶識別并切割不同的核苷酸序列,故圖1中兩種酶識別的核苷酸序列不同,A項正確;重組DNA通常是連接兩個不同的DNA片段,故圖2中酶切產物可用于構建重組DNA,B項正確;分析圖1,限制酶SalⅠ有三處切割位點,切割后產生4個DNA片段,泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產物,C項正確;圖中限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,圖中被酶切的DNA片段是雙鏈DNA,D項錯誤。4.D解析用一種限制酶切割,目的基因在質粒上可以正向或反向插入,進而導致基因轉錄產物的不同,A項正確;用PvuⅠ酶切,氨芐青霉素抗性基因被破壞,用含四環素的培養基培養,能生長的受體菌可能含重組質粒、正常質粒及自身環化的質粒,B項正確;SphⅠ酶切會在重組質粒上產生特定的片段,通過DNA凝膠電泳技術可以分離和檢測這些片段,從而確定重組質粒是否構建成功,C項正確;根據質粒圖示,攜帶目的基因的受體菌需要同時具有AmpR和TetR基因才能在含有氨芐青霉素和四環素的培養基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,會破壞四環素抗性基因(TetR),D項錯誤。5.C解析構建基因表達載體時,需要用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶,A項正確;若從圖中的DNA片段中直接獲取LDH基因,由于DNA每條鏈上有2個磷酸二酯鍵會被破壞,因此被破壞的磷酸二酯鍵共有4個,B項正確;PCR反應過程分為變性(溫度上升到90℃以上)、復性(溫度下降到50℃左右)和延伸(溫度上升到72℃左右)三大步驟,故變性后要先降溫后升溫,C項錯誤;由于TaqDNA聚合酶只能從5'端→3'端延伸子鏈,圖中含磷酸基團端為5'端,含羥基端為3'端,子鏈和模板鏈反向平行,因此根據引物的延伸方向可知,圖中與引物結合的部位是2、3,D項正確。6.A解析可以通過mRNA在逆轉錄酶的作用下合成cDNA,從中獲取目的基因,A項正確;用限制酶和DNA連接酶處理目的基因和Ti質粒,涉及堿基之間的氫鍵和DNA片段之間的磷酸二酯鍵的斷裂和形成,B項錯誤;起始密碼子位于mRNA上,RNA聚合酶識別的位點是基因中的啟動子,C項錯誤;T-DNA可轉移到受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上,但不能保證目的基因導入率為100%,所以農桿菌的轉化不都能培育出轉基因植株,D項錯誤。7.C解析根據題干推測,p1301載體上應含有增強Bapt基因表達的序列,A項正確;超表達載體中應含有潮霉素抗性基因作為標記基因,在含有潮霉素的培養基上,超表達載體能夠存活,從而起到篩選作用,B項正確;由于紅豆杉細胞中本身存在Bapt基因,無論超表達載體是否成功導入,都能與Bapt基因探針形成雜交分子,因此不能通過Bapt基因探針來檢測過程⑤是否成功,C項錯誤;工廠化生產紫杉醇屬于細胞產物的獲得,只需要培養到愈傷組織階段即可,D項正確。8.C解析在核移植過程中,形成重構胚后,還需要用物理或化學方法(如電刺激、Ca2+載體等)激活重構胚,促進其細胞分裂和發育進程,A項正確;導入重組質粒前,需要用Ca2+處理大腸桿菌細胞,使其處于能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,使重組質粒容易進入受體細胞,B項正確;真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此,PCR反應緩沖溶液中一般要加Mg2+,C項錯誤;促進植物原生質體融合的方法有電融合法、高Ca2+—高pH融合法等,D項正確。9.答案(1)只有能利用羧甲基纖維素鈉的微生物才能生長繁殖菌落產生的纖維素酶的活性和量(2)耐高溫的DNA聚合酶(3)基因表達載體的構建限制酶、DNA連接酶(4)繁殖能力強、生理結構和遺傳物質簡單、對環境因素敏感、容易進行遺傳操作等能吸收周圍環境中DNA分子(5)降解時的溫度不同、降解時的pH不同解析由圖可知,①②是利用選擇培養基篩選出高產纖維素酶菌株X,③是提取菌株X基因組DNA,④為基因工程操作程序中“目的基因的篩選和獲取”,⑤為“基因表達載體的構建”,⑥為“將目的基因導入受體細胞”,⑦為從培養體系中分離得到重組酶。(1)選擇培養基只允許特定種類的微生物生長,同時抑制或阻止其他種類微生物生長。在以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的選擇培養基中,只有能利用羧甲基纖維素鈉的微生物才能生長繁殖。剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物,使得含有纖維素的培養基呈現紅色。當纖維素被纖維素酶分解后,剛果紅與纖維素的復合物就無法形成,培養基中就會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這個透明圈的大小直接反映了纖維素分解菌分解纖維素的能力。透明圈越大,說明纖維素分解菌分解纖維素的能力越強,即菌落產生的纖維素酶的活性強、量多。(2)擴增目的基因片段在PCR儀中進行,因此需要耐高溫的DNA聚合酶。(3)根據圖示中酶基因與質粒載體經過過程⑤構成重組質粒,推導出過程⑤為基因表達載體的構建,該過程需要限制酶和DNA連接酶。(4)大腸桿菌作為受體細胞的優點是繁殖能力強、生理結構和遺傳物質簡單、對環境因素敏感、容易進行遺傳操作等。先用Ca2+處理細胞,使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,然后再將重組的基因表達載體導入其中。(5)不同酶的最適溫度、最適pH不同,當溫度和pH改變時,酶促反應速率也會受到影響。10.答案(1)攻擊生物膜,損傷生物膜結構進而影響其功能;攻擊DNA,引起基因突變和DNA損傷;攻擊蛋白質,使蛋白質活性降低延長(2)XbaⅠ、HindⅢ2耐高溫的DNA聚合酶需要Mg2+激活引物設計太短(或引物特異性不強,即與非目的序列有同源性)、兩引物之間堿基互補配對(形成引物二聚體)、復性溫度過低、Mg2+濃度過高、DNA模板出現污染等(3)激活或增強紫色西紅柿中紫色花青素合成的相關基因;編輯轉錄因子的基因解析(1)自由基通常是具有強氧化性的異常活潑的帶電分子或基團。自由基損害細胞主要表現為攻擊生物膜,損傷生物膜結構進而影響其功能;攻擊DNA,造成基因突變和DNA損傷;攻擊蛋白質,使蛋白質活性降低。紫色花青素有抑制癌細胞生長的潛力,因此可使癌細胞的細胞周期延長。(2)據圖可知,最好選用XbaⅠ、HindⅢ切割S基因的cDNA和Ti質粒,既能保證目的基因與載體產生相同的黏性末端,又不破壞目的基因。PCR擴增目的基因時需要2種引物,一般需要往PCR反應緩沖液中加入Mg2+,Mg2+可激活耐高溫的DNA聚合酶。PCR擴增的產物進行電泳時,除了目標序列外還有很多非特異性條帶,出現非目的序列產物的原因可能有引物設計太短(或引物特異性不強,即與非目的序列有同源性)、兩引物之間堿基互補配對(形成引物二聚體)、復性溫度過低、Mg2+濃度過高、DNA模板出現污染等。(3)通過基因編輯,研究人員通常會激活或增強紫色西紅柿中紫色花青素合成的相關基因,從而使紫色西紅柿能夠產生紫色花青素。紫色花青素的合成途徑涉及多個基因,其中包括轉錄因子,這些轉錄因子可以激活或抑制紫色花青素合成相關基因的表達。通過編輯這些轉錄因子的基因,可以增加紫色花青素的產量。11.D解析研磨液有利于DNA的溶解,更換為蒸餾水,DNA提取的效率會降低,A項正確;DNA不溶于酒精,但細胞中的某些蛋白質溶于酒精,所以利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異,可初步分離DNA,B項正確;DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L的NaCl溶液,可利用該原理對DNA進行粗提取,C項正確;在沸水浴的條件下,DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色,故二苯胺試劑可用于鑒定DNA,但不能檢測溶液中是否含有蛋白質雜質,D項錯誤。12.C解析粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中,因為在該濃度的溶液中DNA的溶解度較高,二苯胺可用于鑒定DNA,但需要沸水浴加熱,A項錯誤;加入洗滌劑的目的是瓦解細胞膜,不是細胞壁,B項錯誤;向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水會降低DNA的溶解度進而使DNA析出,C項正確;析出DNA時,玻璃棒應該沿同一個方向攪拌,防止DNA被破壞,D項錯誤。13.BC解析引物是一段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,轉錄的方向由引物的5'向3'進行,引物與模板鏈的3'端開始一段堿基互補配對,不能是3'-ATTTGAAGTCCCA-5',A項錯誤;PCR的過程為高溫變性、低溫復性、中溫延伸,變性需要的溫度最高,變性使DNA解聚為單鏈,B項正確;復制n輪后,DNA分子有2n個,新合成的DNA鏈都有引物,不含引物的DNA鏈是含有兩條母鏈的兩個DNA分子,故同時含有兩種引物的子代DNA分子有2n-2個,C項正確;復性時,溫度過高導致引物與模板鏈不結合,得不到目的產物,溫度過低,引物與模板的結合位點增加,導致PCR擴增出多種DNA片段,D項錯誤。關鍵能力提升練14.C解析啟動子位于基因的上游,是RNA