H

的燕四騙花楷量通道法用限制酶切斷DNA用連接酶連接目的基因連接酶3.2基因工程的基本操作程序DNA合

成

儀

顯微注射技術二、構建基因表達載體1.酶切·

同種限制酶·

防止倒連、自連

→

兩端選擇兩種限制酶·

防止切斷目的基因等

→載體和目的基因選同尾酶·

注意：限制酶特性能被限制性內切酶特異性

識別的切割部位都具有回文序列

：限制酶所識別序列的特點是：呈現堿基互補對稱，無論

是6個堿基還是4個堿基，都可

以找到一條中心軸線，中軸線

兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的

,稱為回文

序列

在切割部位，

一條鏈正

向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。EcoRIc-十-T

A-A-c

工HindlllT-T-cG-A-A—G-G-A-C-C-T-

A

GTaqlA-G

c-(1)限制酶的識別序列BamHI2.連接·DNA連接酶④構建基因表達載體

⑤大腸桿菌

88無菌牙簽

·菌落一乙含青霉獻和四環素含四環素含四環素培養、分離純化內人垂體①

人生長激素mRNA組

織

②cDNA③人生K

激

素基

因EroRIPstlHindlAep淅切制后的質粒3.鑒定·OPCR

法(注意引

物的設計)·

自雙抗生素抗性基

因鑒定·

*測序法火腸桿菌

甲人生長激素Tef1(-)orinp2)pBLUE-T2984bporiPGEM-34轉化培養基中加X-galIPTG菌落藍色質粒的多克隆位點整合在lacz

基因中，在多克隆

位點插入外源目的基因，破

壞了lacZ

基因的結構，大

腸桿菌形成白色的克隆。否則形成藍色克隆。laczPnPkpnlxholSallHincllHindlIEcoRVEcoRlTAcloning

siteEcoRIPstlSmalBamHSpelxbalNotlSacSacl培養基中加X-galIPTG典型例題轉化(transformation)是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表

達的過程。農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。農桿菌細

胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將

Ti

質粒上的T-DNA

(可轉移的DNA)轉移到

被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色

體DNA

上。根據農桿菌的這種特點，如果將目的基因插入Ti質粒的T-DNA

中，通過農桿菌的轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞。根據受體植物的不同，所用的具體轉化方法有

所區別。例如，可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；可以將花序直接浸沒在含有農

桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得

種子，再進行篩選鑒定等。隨著轉化方法的突

破，用農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植

物也取得了成功。三、將目的基因導入受體細胞資料卡農桿菌轉化法1.

將目的基因導入植物細胞(1)農桿菌轉化法一特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多

數單子葉植物沒有感染能力。Ti

質粒上的T-DNA

可以轉移到受體細胞，

并整合到受體細胞染色體的DNA

上。Ti質粒、目的基因

構建

轉入

導入植物細胞植物細胞

表達

染色DNA新性狀注意：大多基因表達載體在受體

細胞內是獨立存在

的!Ti

質粒農桿葡合轉化過程：

具有趨化性(酚)表達載體農桿

菌插入兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti

質粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA

上。兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti

質粒重新導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。將目的基因插入

染

色

體

的DNA中構建基因表現出新性植物組織培養

狀

的

植

株目

的

基

因將目的基因導入到植物細胞中方法------農桿菌轉化法表達載體

Ti質粒導

入植

物細

胞轉

入農

桿

菌重組

Ti質粒(2)花粉管通道法

用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA

溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。2.

將目的基因導入動物細胞(1)

方法：顯微注射法(2)

操作：提純含目的基因表達載體

顯微注射受精卵移植到輸卵管或子宮受精卵發新性狀動物顯微注射技術(2)常用法：

Ca2+處理

(感受態細胞法)常用菌：

大腸桿菌(

3

)

過

程

：Ca2+處

理

感受態大腸桿菌細胞3.

將目的基因導入微生物細胞(1)微生物作受體細胞原因：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少。表達載體與感受態細胞混合感受態細

胞吸收DNA胰島素原胰島素cDNAmRNA21提取

逆轉錄胰島素

S重組質粒質

粒原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物轉化、

E·coli胰腺A鏈mRNAC肽B鏈NH?1COOH30S檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因目檢測目的基因是否轉錄出了mRNA

頭檢測目的基因是否翻譯成蛋白質常用PCR技

術檢測DNA水

平

和RNA

水平用抗原抗體雜交技術檢測蛋白質水平鑒定—

抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等四、目的基因的檢測與鑒定

檢查是否成功檢測一能與目標DNA或RNA的一條鏈發生堿基互補配對。基因探針待

測DNAFDNA

分子限制酶切

①瓊脂糖凝膠電泳硝酸纖維素膜DNA

分子雜交⑦

放

射自

顯

影DNA

片段②電泳③↓變性④↓轉膜加入特異

性探針⑥↓洗膜單鏈DNA

或RNA片段，帶有某種標記(

2

)

方

法

：RNA

分子雜交

(3)方法：抗原-抗體雜交各種RNA

各種蛋白質qSDS-聚丙烯-酰胺凝膠電泳硝酸纖維素膜抗原一抗體雜交⑤放射自顯影①

電泳②

轉膜③

記④

洗膜的抗體加入標①

電

泳②

轉膜③

加入特異

中性探針④

洗膜瓊脂糖凝-

膠電泳硝酸纖-維素膜⑤放射

自顯影分子雜交例

：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。(4)個體生物學水平鑒定鑒定—

抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等基因編輯·1.CRISPR/Cas9·一設計合適的向導序列·

自將向導序列和Cas9基因構建基因表達載體·

為轉化·

④表達并組裝Cas9/gRN

A復合體·

⑤定點切割(敲除絕大部分外顯子/敲除個別外顯子，移碼突變)

·

⑥鑒定(PCR:

擴增出的條帶小或者無條帶/分子雜交/測序)目Cre-lox

介導的基因組特定位點重組·

1、兩個loxP

位點位于同一條DNA

鏈上且方向相同，

Cre

重組酶

敲除loxP

間的序列；·

2、兩個loxP

位點位于同一條DNA鏈上且方向相反，

Cre

重組酶

誘導loxP

間的序列翻轉；·

3、兩個loxP

位點位于不同的DNA鏈或染色體上，

Cre重組酶誘

導兩條DNA

鏈發生交換或染色體易位。Inversion

Deletion

Translocation

GeneX知乎@蓋波和他的小魚干XeneGGenexCrex?uasImage

by

Larissa

Haliw篩選高效表達外源基因的基因座●外源基因置換

至高表達基因

座上。疾病動物模型的

建立●可使某一基因

在特定的組織、

特定的時段被剔除，減輕由

于在全體細胞

中敲除產生的

副作用。基因的定點刪除C外源基因的定點

整合C探究和實踐DNA

的粗提取與鑒定血紅素基α鏈紅血球β

鏈鐵原子β

鏈a

鏈探究-實踐

DNA

的粗提取與鑒定(

一)基礎知識1、提取大分子的基本思路是什么?選用一定的物理、化學方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分

子。2、提取DNA

分子的基本思路是什么?利用DNA

與RNA、

蛋白質和脂質等在物理和化學性質上的差異，提取DN

A,去除其他成分。日

描

述DNA在NaCL

溶液中的溶解度曲線。在NaC1溶液濃度低于0.14mol/L時，DNA的溶解度隨

NaC1溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14

mol/L時，DNA

溶解度最小；當NaC1

溶液濃度繼續增加時，DNA

的溶解度又逐漸增大。如何通過控制NaC1

溶液的濃度使DNA

在鹽溶液中溶解或析出?先用2mol/L

NeC1溶液溶解DNA,

再加入蒸餾水，使其溶液濃度從2mol/L下降到0.14mol/L,使DNA

在鹽溶液中析出。資料：當氯化鈉的物質的量濃度為2

mol/

工時，DNA

的溶解度最大溶解度NaCI濃度圖5-1DNA在NaCI溶液中的溶

解度曲線酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精),但細胞中蛋白質可溶于酒精。問：采用DNA

不溶于酒精的原理，可以達到什么目的?將DNA

和蛋白質進一步分離合高溫-大多數蛋白質

在60～80℃時變性沉淀，而DNA在80℃以上才會變性。為洗滌劑一溶解細胞膜，去除

脂

質

、

蛋

白

質但對DNA沒有影響。3、DNA

對酶、高溫和洗滌劑的耐受性一蛋白酶一水解蛋白質，對DNA沒有影響。圖5

-

2

洗滌劑瓦解細胞膜的示意圖4、DNA

的鑒定在沸水浴條件下，DNA

遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此用二苯胺試劑鑒定DNA

分子。DNA

+二苯胺

沸水澄→

藍色方法步驟·30g

洋蔥加10ml

研磨液充分研磨·

過濾，4℃放置幾分鐘，取上清液(也可離心1500r/min,5min)·

加入等體積預冷酒精(95%),靜置2-3min·

玻璃棒卷起絲狀物，吸去水分(或者離心10000

r/min,5min)·

溶于5ml,2mol/

工的NaCl

中，加入4ml二苯胺試劑，沸水浴

5min研缽(加研磨液充分研磨，直至出現大量泡沫)過濾至塑料燒杯3-4mL

體積分數為95%的冷卻的酒精取5

g

菜花+

2-3mL研磨液輕輕震蕩，出現白色絮狀物1d1破碎細胞溶解核內DNA析出含DNA的

黏稠物過濾