ICS65.020.99CCSB05

GXTC團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/GXTC0015—2024菠蘿蜜抗寒基因挖掘技術(shù)規(guī)范基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)Technicalspecificationofjickfruit coldresistancegeneminingbasedontranscriptomesequencingtechnology2024-11-29發(fā)布 2024-12-06實(shí)施廣熱帶物學(xué)會(huì) 發(fā)布T/GXTC0015T/GXTC0015—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所提出并宣貫。本文件由廣西熱帶作物學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所。本文件主要起草人：杜英俊、朱鵬錦、唐秀觀、鐘云婕、何江、歐景莉、葉維雁。T/GXTC0015T/GXTC0015—2024PAGEPAGE1菠蘿蜜抗寒基因挖掘技術(shù)規(guī)范基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)范圍本文件適用于篩選菠蘿蜜抗寒基因。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T35890 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)序列格式規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 transcriptomesequencing通過(guò)二代測(cè)序平臺(tái)快速全面地獲得某一物種特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本及基因序列，可以用于研究基因表達(dá)量、基因功能、結(jié)構(gòu)、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)等。fastq格式 fastqformat（通常是核酸序列質(zhì)量控制 qualitycontrolNGC測(cè)序片段 sequencingfragment高通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的含有堿基序列和質(zhì)量值的序列片段。差異表達(dá)基因 differentiallyexpressedgenes（DEGs）通過(guò)閾值法、統(tǒng)計(jì)法或者其他檢驗(yàn)方法，篩選出組間的表達(dá)水平存在顯著差異的基因。差異倍數(shù) foldchange根據(jù)同一個(gè)基因或轉(zhuǎn)錄本在不同條件下表達(dá)豐度差異的倍數(shù)。原理儀器設(shè)備及試劑儀器：Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)、瓊脂糖凝膠電泳儀、分光光度計(jì)、熒光計(jì)、生物分析儀。試劑：RNA提取試劑盒。品種選擇與使用品系選取選取生長(zhǎng)勢(shì)一致耐寒品系(GXRZBLM00051，編號(hào)為A)和不耐寒品系(GXRZBLM00006，編號(hào)為B),（3～4AB樣品制備分別選取兩個(gè)品系的菠蘿蜜各5棵樹(shù)，從東南西北四個(gè)方向隨機(jī)采集葉片，將葉片用去離子水（ddH?O）洗凈后放液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃凍存。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程RNA提取總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，操作按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA分析RNA的完整性及是否存在DNA污染；檢測(cè)RNA純度（OD260/280和OD260/230）；測(cè)定RNA濃度。檢測(cè)RNA完整性。文庫(kù)構(gòu)建按下列步驟執(zhí)行：polyAmRNA；RNAcDNA；cDNA；cDNA；cDNAA片段大小選擇；PCRcDNA文庫(kù)質(zhì)檢初步定量使用熒光計(jì)進(jìn)行初步定量，使用生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度（insertsize）進(jìn)行檢測(cè)，插入片段長(zhǎng)度符合預(yù)期后才可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確定量運(yùn)用Q-PCR（熒光定量PCR）方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2nM），完成庫(kù)檢。上機(jī)測(cè)序庫(kù)檢合格后，用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后得到原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)為fastq格式。生物信息學(xué)分析步驟測(cè)序數(shù)據(jù)及質(zhì)量控制測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾過(guò)濾流程如下：去除帶接頭（adapter）reads；readNread10pairedreads；rdQ0rad0%aredreads。測(cè)序錯(cuò)誤率分布測(cè)序錯(cuò)誤率計(jì)算公式如式（1）:-10o10e) 1）式中:Qphred——Illumina的堿基質(zhì)量值；e ——測(cè)序錯(cuò)誤率。GC含量分布檢查測(cè)序讀段在每個(gè)位置的GC及AT含量應(yīng)分別相等，且在整個(gè)測(cè)序過(guò)程基本穩(wěn)定不變。轉(zhuǎn)錄本拼接拼接無(wú)參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用Trinity軟件對(duì)cleanreads（經(jīng)過(guò)處理后去除低質(zhì)量、含有接頭的reads）進(jìn)行拼接以獲取后續(xù)分析的參考序列。Corset使用Corset比對(duì)轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)和表達(dá)模式，對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行層次聚類(lèi)，層次聚類(lèi)后的序列信息以FASTA格式儲(chǔ)存。轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列作為后續(xù)分析的參考序列，以Corset層次聚類(lèi)后得到最長(zhǎng)Cluster序列作為Unigene進(jìn)行后續(xù)的分析。基因功能注釋將Unigene序列與KEGG、NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、Trembl數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，預(yù)測(cè)完Unigene的氨基酸序列之后，與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)與NR庫(kù)的比對(duì)，查看本物種轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況和同源序列的功能信息。GO分類(lèi)對(duì)基因進(jìn)行GO注釋之后，將注釋成功的基因按照GO三個(gè)大類(lèi)生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能的下一層級(jí)進(jìn)行分類(lèi)。KOG運(yùn)用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)，將功能注釋直接繼承給同一KOG簇的其他成員。CDS對(duì)組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行CDS（編碼序列）預(yù)測(cè)，按下列步驟進(jìn)行：進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）100UniprotPFAMCDSORF。基因表達(dá)定量步驟如下：將Trinity組裝并去冗余之后的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列，將每個(gè)樣品的cleanreads（經(jīng)過(guò)處理后去除低質(zhì)量、含有接頭的reads）往參考序列上比對(duì)。對(duì)樣品中的MappedReads（成功比對(duì)到參考基因組上的reads）的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化，讓片段數(shù)目能真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。c）采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，F(xiàn)PKM計(jì)算公式如式（2）：式中：

mappedfragmentsoftranscriptoalCntfaedrgmnslos）eghfrsrpb)

…………（2）FPKM——每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments；mappedfragmentsoftransctipt——比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄組本上的片段數(shù)目，即雙端Reads數(shù)目；TotalCountofmappedfragments（Millions）——比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組本上的片段總數(shù)，以10^6為單位；Lengthoftranscript(kb)——轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，以10^3個(gè)堿基為單位。樣品基因表達(dá)量整體分布樣品相關(guān)性分析rR2.8。主成分分析差異基因篩選差異表達(dá)基因分析和篩選條件設(shè)置按下列步驟執(zhí)行：DESeq2RreadsRPKM、FPKM對(duì)假設(shè)檢驗(yàn)概率（Pvalue）進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）。o2odane≥1DR<0.5。reads原始計(jì)數(shù)對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的reads數(shù)目。差異基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)每組的差異基因總數(shù)、上調(diào)基因數(shù)、下調(diào)基因數(shù)。差異基因信息匯總對(duì)每個(gè)差異分組計(jì)算得到差異基因信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總。M-versus-Aplot利用MA圖分析基因的表達(dá)水平和差異倍數(shù)的整體分布。volcanoplot分析利用火山圖分析兩組樣品中差異基因的整體分布情況。基因表達(dá)聚類(lèi)分析將各比較組合差異基因做層次聚類(lèi)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析差異表達(dá)基因功能注釋將基因注釋到KEGG、GO、KOG數(shù)據(jù)庫(kù)后，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)通路包含的差異基因數(shù)量。KEGG富集分析Pathway（通路顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中Pathway為單位，找出與整個(gè)基因組背景Pathway。KEGGPathwayKEGGKGGRhcr個(gè)數(shù)的比值）、Qvalue（Q值）和富集到此通路上的差異基因個(gè)數(shù)來(lái)衡量。Richfactor越大，表示富集的程度越大。Qval