T/CSHBTechnicalspecificationsforrapiddetectionofswinefeverusingPCR2024-7-22發(fā)布I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 5試劑和材料 6儀器與設(shè)備 7樣品采集與處理 8檢測(cè) 9存儲(chǔ) 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由唐山怡安生物工程有限公司提出。本文件由河北省版權(quán)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：唐山怡安生物工程有限公司、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、北京動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、杭州依思康醫(yī)藥科技有限公司、唐山獸醫(yī)檢驗(yàn)檢測(cè)研究院有限公司、河北國(guó)安生物工程有限公司、蘇州潤(rùn)利生物技術(shù)有限公司、北京快樂(lè)星生物科技有限公司、北京貝妥妥動(dòng)物保健科技有限公司、河北寶盈生物技術(shù)有限公司、北京寶易生物技術(shù)有限公司、華北理工大學(xué)、中德信息技術(shù)（天津）有限公司。本文件主要起草人：李潤(rùn)、劉靜、裴雅芳、陳兆婧、李辰龍、陳晴、李麗、李松勵(lì)、李明、劉激雨余琦、張啟龍、馬宏偉、韋景平、顧文源、韓慶安、陳斌、吳超、柴文琴、查銀河、舒建洪、高云、楊廣利、李振義、鐘啟迪、楊曉明、楊宇、安志軍。1豬瘟熒光PCR快速檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了豬瘟熒光PCR快速檢測(cè)技術(shù)的試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品的采集與處理、操作方法、結(jié)果判定和存儲(chǔ)。本文件適用于豬瘟快速檢測(cè)，適用于對(duì)臨床樣本中的豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）RNA進(jìn)行定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存于運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范GB/T27540-2011豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。擴(kuò)增Amplification指基因擴(kuò)增，細(xì)胞內(nèi)染色體上的某一個(gè)基因選擇性地拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象。3.2擴(kuò)增曲線AmplificationCurve指在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系內(nèi)生物分子的濃度變化，得到的曲線圖。4縮略語(yǔ)熒光PCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxfluorescein）CSFV：豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）2DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethlpyrocarbonate）5試劑和材料除另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純，所有試劑均用無(wú)RNA酶的容器分裝。5.1.1RNA核酸提取試劑盒5.1.2PCR反應(yīng)液5.1.3陽(yáng)性對(duì)照品5.1.4陰性對(duì)照品5.1.5酶混合液5.1.6DEPC水去離子水中加入0.1%DEPC，37°C作用1h121±2）°C，高壓滅菌15min。5.2材料放血工具、離心管、一次性手套、真空采血管（含EDTA抗凝劑）、研缽/組織勻漿器、開口器、消毒劑、編號(hào)筆、消毒液容器、拭子等。6儀器與設(shè)備6.1核算提取儀6.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4°C，離心速度可達(dá)12000g以上6.3渦旋震蕩儀6.4冰箱：2~8°C和-20°C以下6.5適用儀器試劑盒適用于ABI7000/7300/7500/7900、ABIStepOnePlus、宏石SLAN-48P/96S、RochelightCycler480、RochelightCycler96、AglientMX3000P/3005P、iCycleriQ、Bio-RadCFX96等熒光定量PCR儀。37樣品采集與處理樣品采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行，樣本類型為RNA病毒，且需在提取后盡快檢測(cè)。7.2采樣人員采樣人員需經(jīng)過(guò)專業(yè)技術(shù)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)、掌握采樣技術(shù)的人員實(shí)施。7.3樣品采集7.3.1全血樣品采集生豬樣品采集部位為豬耳緣靜脈或前腔靜脈血液，生豬采集2mL~5mL血液置于真空采血管（含EDTA抗凝劑）中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.2拭子樣品采集用無(wú)菌拭子在鼻腔內(nèi)或口腔內(nèi)輕輕擦拭并緩慢旋轉(zhuǎn)至少3周，或用無(wú)菌拭子輕輕擦拭眼分泌物后，將拭子置于DEPC水中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.3內(nèi)臟組織樣品采集采集適量肝、脾、肺組織樣品，并按1：5倍體積加入DEPC水，研磨勻漿，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.4糞便樣品采集稱取適量糞便樣品置入無(wú)菌保存管中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.3.5活體樣品采集固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采取扁桃體樣品，用滅活牙簽挑至無(wú)菌管中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?.4樣品處理7.4.1全血樣品處理血液混勻后，轉(zhuǎn)入容量為1.5mL滅菌離心管中，直接用于核酸提取。7.4.2拭子樣品處理4將含有鼻咽拭子或口腔拭子或眼分泌物拭子樣品，搖勻，保存管在渦旋震蕩儀上充分混合，在4°C以下3000rpm離心5min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中。7.4.3內(nèi)臟組織和糞便樣品處理將含有組織或糞便勻漿液無(wú)菌保存管在渦旋振蕩儀上充分混合后，在4°C以下3000rpm離心15min，取上清液。7.4.4活體組織樣品處理取適量樣本于研缽或組織勻漿器中充分研磨，3000rpm15min，取上清液。8檢測(cè)8.1檢測(cè)方法8.1.1核酸提取在樣本制備區(qū)進(jìn)行。按照GB/T27540-2011執(zhí)行。8.1.2擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在試劑存儲(chǔ)和準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。將試劑盒從-20°C冰箱取出，冰浴條件下融化，待其融化完全后，振蕩混勻，瞬時(shí)離心，并按表1體系，在0.2mLPCR管中配制反應(yīng)液。表1擴(kuò)增試劑配制成分體積CSFV-PCR反應(yīng)液酶混合液總體積20μL8.1.3熒光PCR擴(kuò)增體系將提取的樣本RNA，取5μL上樣。8.1.4PCR擴(kuò)增按如下步驟設(shè)置熒光定量PCR儀的程序：表2操作步驟步驟溫度循環(huán)數(shù)150°C5min295°C395°C40cycle62°C30s（采集熒光步驟）5儀器檢測(cè)通道選擇：選擇FAM通道（Reporter：FAM）檢測(cè)CSFV；具體檢測(cè)通道設(shè)置可參照各儀器使用說(shuō)明。8.2檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)樣本擴(kuò)增曲線和Ct值組合判定，陽(yáng)性/陰性，具體數(shù)值如下：1、檢測(cè)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：如果陽(yáng)性對(duì)照品有擴(kuò)增曲線且Ct值≤30，空白對(duì)照的無(wú)擴(kuò)增曲線，則本次試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無(wú)效。2、結(jié)果判斷：a）如果檢測(cè)樣本有擴(kuò)增曲線且Ct值≤35，報(bào)告為CSFV檢測(cè)陽(yáng)性。b）如果檢測(cè)樣本有擴(kuò)增曲線且