TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofduckTembusuVirusHYPERLINK安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。1鴨坦布蘇病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨坦布蘇病毒病料采集與處理、病毒接種及鑒定技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。DB34/T1938鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程3試驗(yàn)材料、試劑3.19～11日齡SPF雞胚3.211日齡鴨胚3.3乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)3.4DMEM培養(yǎng)基3.5胎牛血清3.60.01mol/LpH7.0～7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)3.7TAE緩沖液(50×)3.8青霉素、鏈霉素3.9瓊脂糖3.10鴨坦布蘇病毒瓊脂擴(kuò)散抗原(由鴨坦布蘇病毒安徽分離株醛滅活制備而成)3.11鴨坦布蘇病毒瓊脂擴(kuò)散抗體(由鴨坦布蘇病毒安徽分離株油乳佐劑滅活制劑免疫健康兔，份離血清制備而成)4病料采集與處理4.1病料的采集無(wú)菌采集疑似鴨坦布蘇病毒感染的病鴨卵巢、輸卵管、胰腺和腦組織。樣品應(yīng)置于-80℃凍結(jié)保存。4.2病料的初步處理先將病料組織剪碎、研磨，用滅菌PBS與樣品按體積質(zhì)量比5:1勻漿，將樣品勻漿放置于-20℃中冷凍，再室溫融解，反復(fù)三次。經(jīng)5000r/min離心10min,取上清，并加入青霉素和鏈霉素，終濃度為2000IU/mL,0.22μm過(guò)濾除菌，置于-80℃待用。25病料接種將上述病毒分離材料，以0.2mL/胚的接種量通過(guò)尿囊腔接種5枚9～11日齡SPF雞胚，置37℃孵化箱內(nèi)孵育，每天照胚2～4次，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，孵化至120h,將雞胚放置4℃冰無(wú)菌操作收集24h以后死亡雞胚及120h仍存活雞胚的尿囊液，并觀察病變。將上述病毒分離材料，以0.2mL/胚的接種量通過(guò)尿囊腔接種5枚11日齡鴨胚，其余方法同取密度80%左右的單層BHK-21細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗三次，接種0.5mL處理好的病料，置于5%CO?培養(yǎng)箱，37℃下吸附1～2h,期間每隔15min輕輕搖晃一次。吸附完后，棄去病料液，用滅菌PBS清洗三次，加入適量細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，37℃CO?培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4d。在培養(yǎng)過(guò)程中每日觀察細(xì)胞病變(CPE)產(chǎn)生情況，如出現(xiàn)CPE(特征病變?yōu)椋杭?xì)胞間隙增大、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞圓化脫落),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液。同時(shí)設(shè)立不接種樣品的空白細(xì)胞對(duì)照瓶。6病毒鑒定1938鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程，或者使用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)鴨坦布蘇病毒進(jìn)行鑒定。用1×TAE緩沖液配置1%瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻至60℃左右，倒入平皿(直徑9cm)中制作瓊脂糖凝膠板，瓊脂糖凝膠厚度約4mm,完全凝固后備用。用梅花打孔器在上述瓊脂糖凝固板上打孔，用孔徑5m、孔距奮品射孔結(jié)束店取適量1%瓊脂7.3加樣用移液器在中間孔加入坦布蘇病毒陽(yáng)性血清，1號(hào)孔加入坦布蘇病毒瓊擴(kuò)標(biāo)準(zhǔn)抗原，2～6號(hào)孔加每孔樣品加滿，不可溢出(圖1)。完成加樣后，將瓊脂板倒置放入濕盒內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱中24～36h。35423圖18結(jié)果判定8.1由本病毒致死的雞胚及鴨胚具有基本相同的肉眼病變。胚體小、絨毛尿囊膜增厚、胚體充血及胚肝出血。8.2BHK-21細(xì)胞接種病料48h后，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、細(xì)胞圓化脫落。8.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)目的片段時(shí)，初步判定為鴨坦布蘇病毒陽(yáng)性。8.4被檢樣品孔與陽(yáng)性血清孔之間形成一條致密白色沉淀帶，并與陽(yáng)性對(duì)照沉淀帶平滑相連，即可判斷為陽(yáng)性。8.5被檢樣品孔與陽(yáng)性血清孔之間無(wú)沉淀帶出現(xiàn)；出現(xiàn)的沉淀帶與陽(yáng)性對(duì)照交叉或者不相連，為非特異性反應(yīng)，也判定為陰性。8