1T/THXCYxxx-xxxx紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術規程本標準規定了紫花苜蓿（MedicagosativaL.）基因型高通量鑒定的主要技術內容，包括紫花苜蓿gDNA提取與檢測、cGPS測序文庫構建、生物分析流程等。紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析基于紫花苜蓿60K液相芯片開展靶向捕獲測序，能夠對大規模紫花苜蓿群體開展高效、精準、低成本地基因型分型檢測，基于分型結果，可在紫花苜蓿育種或輔助育種中開展應用，主要包括群體遺傳主效基因選擇、分子標記輔助育種定向改良、全基因組選擇育種、紫花苜蓿品種真實性鑒定、遺傳圖譜構建、基因定位和種質資源遺傳多樣性評價等。本標準適用于紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30989—2014高通量基因測序技術規程GB/T40171—2021磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測通則DB32/T3860—2020玉米品種及純度鑒定技術規程SNP標記法T/JSFT/JSF001—2024美洲黑楊性別苗期鑒定技術規程——SSR分子標記法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1基因gene位于染色體上編碼一個特定功能產物（如蛋白質或RNA分子）的一段核苷酸序列，是遺傳信息的基本單位。3.2文庫library2T/THXCYxxx-xxxx通過生物來源、人工合成或克隆技術等得到的重建分子群，如基因組文庫。3.3探針probe能識別特定堿基序列的、經過人工標記的一小段單鏈核酸分子。3.4高通量基因測序high-throughputgenesequencing區別于傳統雙脫Sanger測序，高通量測序能夠一次并行對大量核酸片段序列進行大規模平行測定的技術，通常一次測序反應能產出不低于100Mb的測序數據。3.5基因型genotype指一個生物體內的DNA所包含的基因，也就是說該生物的細胞內所包含的、它所特有的那組基因。3.6引物primer在DNA復制過程中，結合于模板鏈上并作為復制延伸的起始位點和/或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。3.7DNA聚合酶DNApolymerase以一條DNA鏈作為模板合成一條新的DNA鏈時所需要的酶。3.8DNA連接酶DNAligase在DNA復制、修復和重組過程中，由發揮作用的催化磷酸二酯鍵合成的酶。3.9SNP標記SNPmarker是指在基因組上單個核苷酸的變異，形成的遺傳標記，其數量很多，多態性豐富。3.10液相基因芯片liquid-phasegenechip是通過挑選目標區域多態性高、缺失率低、分布均勻的標記位點信息作為參考設計探針，并合成特異性液相芯片，在液相環境下對目標區域序列的定向捕獲富集和高通量測序。3.11cGPSGenotypingbyPinpointSequencingofliquidcapturedtargets3T/THXCYxxx-xxxx基于優化的熱力學穩定性算法模型對目標區間序列進行特異性探針設計，利用合成的特異性探針對位于不同基因組位置的多個不同目標序列進行液相雜交捕獲富集，然后對捕獲富集的目標區間進行文庫構建和二代高通量測序，從而獲得目標區間內的所有SNP/InDel標記位點的基因型。4儀器與設備4.1渦旋震蕩器4.2移液器4.3離心機4.4磁力架4.5高通量自動化核酸提取儀或工作站4.6微量紫外分光光度計或酶標儀4.7PCR儀4.8熒光定量PCR儀4.9電泳儀4.10凝膠成像系統4.11真空濃縮儀4.12ArrayTape基因分型系統4.13SNPlineSNP分型系統4.14Illumina測序平臺4.15服務器5測定為保證測序數據的質量，在樣品提取、文庫構建、雜交捕獲和測序各環節均設置質控點，對每一個步驟都進行嚴格質控，從根本上確保基因型分型數據的準確性。5.1樣品DNA提取與質控采集待檢測紫花苜蓿材料的新鮮葉片，利用磁珠法從組織中提取gDNA，按照GB/T30989-2014的規定執行。用Qubit熒光定量儀檢測DNA樣品的濃度；用1%瓊脂糖凝膠電4T/THXCYxxx-xxxx泳檢測DNA樣品的完整性，DNA體積≥50μL，濃度≥10ng/μL；OD260/280值=1.8-2.0，OD260/230值≥1.8的樣品用于文庫制備。5.2cGPS文庫構建與質控a.利用酶切試劑將DNA樣品酶切成100-500bp大小片段后，加入Taq酶進行末端修復，并在3’端加上A堿基，用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。b.使用T4連接酶連接測序接頭與DNA片段兩端，利用磁珠對連接產物進行純化。純化后的產物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。c.對純化后的連接產物進行PCR擴增，利用磁珠對擴增產物進行片段篩選。片段篩選后的產物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。d.取200ng質檢合格的PCR產物構建雜交文庫，使用真空濃縮儀對混合文庫進行濃縮。之后加入基因組封阻試劑、RNA酶抑制劑（RnaseBlock）與探針液后，50℃孵育16小時-24小時完成雜交反應；將磁珠加入到雜交產物中進行目標區段捕獲，室溫結合30min-60min，吸附探針和目的區間結合體；使用清洗液清洗捕獲產物，去除非特異性結合片段；再進行一輪PCR擴增，擴增產物使用片段分選磁珠進行純化，去除多余引物和引物二聚體，即完成cGPS測序文庫構建。5.3上機測序文庫構建完成后，利用Qubit熒光定量儀對文庫濃度進行測定，采用Agilent2100/2200Bioanalyzer檢測文庫質量，文庫片段大小應在250bp-500bp之間。文庫質檢合格后，按照測序平臺的標準，進行上樣及測序。6.生物信息分析基于紫花苜蓿液相芯片捕獲技術的基因型鑒定分析流程主要分為以下四部分：（1）測序數據質控：將原始下機數據進行過濾并評估測序質量，并進行污染檢測；（2）比對及質控：將過濾后的測序數據比對到參考基因組，并計算相應質控指標；（3）變異檢測及注釋：檢測單核苷酸變異（SNP）、小片段插入缺失變異（InDel）及注釋；5T/THXCYxxx-xxxx（4）檢測指標計算：根據變異檢測結果，統計樣本水平及位點水平的質控指標。6.1測序數據質控6.1.1測序數據格式高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別（BaseCalling）分析轉化為測序序列（Reads結果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲，FASTQ文件的名稱、堿基序列以及其對應的測序質量信息。6.1.2原始數據過濾測序得到的紫花苜蓿原始測序序列（RawReads使用fastp軟件對原始序列進行過濾，去除含有接頭污染的Reads和低質量的Reads，得到高質量的CleanReads，使用CleanReads進行后續分析。6.1.3測序數據質量評估堿基測序質量值反映測序錯誤率，每個堿基的測序錯誤率是通過將測序Phred數值（Phredscore，Qphred）按照特定公式進行轉換后計算得出，而測序質量值是在堿基識別過程通過一種預測堿基判別發生錯誤概率模型計算得到。6.1.4測序數據堿基含量檢測堿基分布檢查用于檢測有無AT、GC分離現象。理論上G和C堿基及A和T堿基含量每個測序循環上應分別相等，且整個測序過程穩定不變，呈水平線。6.1.5測序數據污染檢測從每個樣品的fastq文件中隨機選擇10,000條序列，利用blastn將序列比對到NCBINT數據庫，進行污染評估。6.2參考基因組比對6T/THXCYxxx-xxxx利用比對軟件BWA，將過濾后的CleanReads與紫花苜蓿參考基因組（“新疆大葉”或“中苜4號”基因組）進行比對，定位CleanReads在參考基因組上的位置，統計比對結果。比對率能反映樣本、建庫及測序、紫花苜蓿60K液相基因芯片標記序列的質量以及測序數據與紫花苜蓿參考基因組的相似程度。6.3目標位點變異分析基因組變異是指在基因組水平上核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，包括SNP、InDel等。基于CleanReads參考基因組序列比對結果，通過突變分析軟件GATK的檢測工具HaplotypeCaller進行靶向位點的基因型檢測。利