廣西地方標準《芒果品種鑒定技術規程SSR分子標記法》

編制說明（征求意見稿）

一、制定意義及任務來源

1目的意義

目前，通過分子生物學和生物信息學相結合的方法在基因水平對種質資源生物多樣性進行鑒定已經

成為作物學領域研究熱點。2015年4月，農業部印發《農作物品種DNA身份鑒定體系構建實施方案》

中指出“現代種業是國家戰略性、基礎性核心產業，品種創新是現代種業發展的核心，品種保護與管理

是品種創新的必要保障。目前，生物技術的快速發展，移動互聯、大數據引發的產業變革，為品種管理

向田間表型身份鑒定與室內基因型（DNA,即脫氧核糖核酸）身份鑒定相結合的方向發展提供了有力的

技術支撐”。因此構建品種DNA身份鑒定體系是加強種子管理、保障市場公平競爭、保護農民合法權益、

提升品種創新能力和推進種業信息化發展的需要。

分子標記鑒定是從DNA水平直接反映品種或親子間的差異，不受植物發育階段、組織器官、季節、

環境和表達等條件的限制，同時DNA標記數量大、多態性豐富等諸多特點，現已在品種鑒定、圖譜構建、

基因定位等研究中廣泛應用。分子標記技術之一SSR即簡單重復序列（SimpleSequenceRepeat）或微衛

星DNA（MicrosatelliteDNA）O它通常是指以2~5個核甘酸為單位的多次串聯重復DNA序列，長度大

多在100~200bp。SSR在基因組中分布廣泛，由于重復次數的不同而引起不同材料間的差異，通常表現

為共顯性。SSR兩端有一段相對保守的序列，根據保守序列設計引物進行PCR擴增就可獲得SSR片段。

由于SSR分布廣泛，具有多態性好、表現為共顯性、對DNA質量要求低且用量少的諸多特點，己經廣泛

應用于植物遺傳多樣性分析、雜種鑒定、指紋圖譜構建、基因定位等方面。可以用于植物品種權精準授

權、打假與維權，為《種子法》的實施提供了可靠的技術手段。

芒果（MangiferaindicaL.）,漆樹科，杞果屬。果皮顏色有紅中帶黃、黃中帶青、青中帶黃、純青色

等。果肉為黃色，鮮美多汁，有濃郁的芳香氣味。內部有一粒種子，種子為扁平形。素有“熱帶果王”

之美譽，是世界上著名的熱帶水果，據世界糧農組織（FAO）統計，2016年全世界芒果實際收獲面積和

產量分別為9616.6萬畝和5127.9萬噸；芒果亦是我國重要的熱帶水果之一，我國主要種植地區為廣東、

廣西、海南、云南、福建和臺灣等地，5-9月為盛產期。在面積上僅次于香蕉、荔枝和龍眼，居第四位，

據農業部南亞辦數據顯示，2019年全國芒果種植面積達484.2萬畝，產量278.2萬噸（臺灣未計入），產

值190.3億元。2015年，廣西芒果產量超過海南成為最大的芒果產地，居全國首位。2020年廣西芒果果

園面積153.93萬畝，產量79.81萬噸，產值50.7億元。廣西百色與海南、攀枝花并稱我國三大芒果之鄉，

百色市是我國最大的芒果生產基地，近年來百色為廣西芒果貢獻了大部分產量，芒果產業已成為當地農

業支柱產業之一，是當地農民收入的主要來源。

廣西芒果品種主要有臺農1號芒、金煌芒、紅象牙芒、桂熱芒82號、桂七芒、貴妃芒、桂熱芒10

號、凱特芒、新世紀芒等29個品種。單從形態上鑒定存在一定困難，這就給芒果品種的選育、生產、經

營和使用等方面造成不同程度的困擾，同時也給種子管理部門帶來一定的挑戰。我國已出臺了一系列主

要農作物品種的SSR分子標記鑒定行業標準和地方標準，而目前尚無利用SSR標記技術鑒定芒果品種真

偽的方法標準。制定相應的廣西地方標準，規范利用SSR標記技術鑒定芒果品種真實性，對品種管理、

質量監控等方面具有重要意義，且對雜種優勢群的劃分、種質創新及新品種的選育等具有指導意義。

2任務來源

2018年由廣西檢驗檢疫標準化技術委員會提出的《芒果品種鑒定技術規程SSR分子標記法》的制定

計劃，2018年廣西壯族自治區質量技術監督局在關于下達《2018年第一批廣西地方標準制定項目計劃的

通知》附件文中批準將其列入2018年第一批廣西地方標準制定項目計劃(序號：2018-0114),由廣西益譜

檢測技術有限公司、廣西出入境檢驗檢疫局技術中心、南寧維爾凱生物科技有限公司等主要負責起草該

地方標準的制定任務。

二、工作概述

1國內外相關研究

松果(Mango/Mangi于eraindicaL.),別名芒果、檬果、望果、濟果、悶果、蜜望子、庵波羅果等，為

漆樹科CAnacardiaceae)杞果屬(Mangifera)植物，常綠果樹，有"熱帶果王"之美譽，世界五大名果

之一。由于忙果從起源到馴化的過程復雜、不同地區之間引種、地方品種沒有確切的科學名稱等，近年

來，我國各地科研工作者在種質資源調查和收集研究時，大多都局限于某一地區，各自從不同的角度對

忙果進行了種下分類，同一個品種在不同省份的參試和審定的進程往往也不一致，同一品種在不同省份

通過審定后該品種的標準樣品存在差異，另外，在多個省份審定的情況下，不同單位對同一品種的不同

命名，還有竊用他人品種后換名審定的，從而導致一定數量上的仿冒雷同，品種間親緣關系不明確，而

且從形態特征上很難將其準確歸類，給枯果品種管理帶來一定的混亂。因此，為了更好的保護現有松果

的品種權和新品種的鑒定，應堅持品種命名的唯一性原則，需要建立起一種快速、準確、可靠、高效的

忙果種質資源鑒定方法，而傳統鑒定評價方法，都有一定的局限性。目前世界上約有杞果品種1000多

個，我國約有200個松果品種或品系。杞果具有豐富的遺傳多樣性，果實的大小、形狀、色澤、纖維多

少、核大小等是區別枯果品種的主要依據，但秋果的品種、品系很多，過去多用實生苗繁殖，產生了許

多自然雜交種，新的品種又不斷地被人工培育出來，由于存在飾變和觀察標準不同，依據植物學性狀難

以對枯果資源進行準確分類，導致同物異名、同名異物和資源重復保存等現象嚴重。

M.T.Wahdan等利用SSR標記對42對引物進行了篩選，其中36對引物具有可重復的多態性DNA擴

增模式。在這兩個品種的水果中，60.7%的得分片段被認為是假定的基因型特異性標記。多態信息含量

(P/C)在0.25~0.75之間，平均為0.51。Hania和Ami品種的水果的雜合度分別為0.68和0.53。通過對

這36對引物的條帶分析，可以區分出不同的品種的水果，說明利用SSR引物進行PCR是一種有效的基

因型鑒定方法，可以利用DNA指紋圖譜描述和鑒定兩個埃及芒果新品系的園藝初步研究(Preliminary

HorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsingDNAFingerprint.?；

A.Sennhenn等用19個簡單序列重復標記對38棵芒果干葉片進行分子分類，研究肯尼亞東部和中部芒果

地方品種的形態和分子特征。利用Nei's遺傳距離和鄰居連接方法建立了芒果樣品間的遺傳親緣關系樹

狀圖。形態學鑒定得出6個不同的聚類(7de"頌ofmango(MangiferaindicaL.)landracesfromEastern

andCentralKenyausingamorphologicalandmolecularapproach)；ManalEidt等采用-簡單序列重復(SSRs)

技術對25個埃及芒果品種的遺傳變異程度進行了分析，并建立了指紋圖譜。根據35個SSR標記的可重

復性、可分離性和品種間的分離能力，選擇了35個SSR標記。35個SSR位點產生219個多態性高的等

位基因(約100%)。通過多態位點百分比、觀察到的等位基因數、有效等位基因數、觀察到的雜合度、預

期雜合度、固定指數和基因流等參數，計算了栽培種質的等位基因初變異率和遺傳基礎(Ejficiency

ParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMangoCultivarsandTheirSuitabilityinMolecular

Bar-codingSSR)。

石勝友，張燕梅，武紅霞等采用SSR標記方法，對來自7個國家的36份松果品種進行了遺傳相似

性分析，目的是為忙果育種親本合理選配、現有國外種質的充分發掘利用提供科學依據；王靜毅等人應

用SSR技術對廣西主要柱果資源遺傳關系進行SSR分析，對48個枯果品種(系)的遺傳關系進行了檢

測。廣西主要松果資源品種間的遺傳相似系數在0.4559~0.9412之間，平均為0.7053,以桂熱枯06-3號

與桂熱枯06-5號兩者之間的相似系數最小，而Keitt與紅凱特松及玉文杞與蜜桃忙之間相似系數最大。

UPGMA聚類分析將48個品種分為5大類群。聚類結果表明，在分子水平上，杞果品種間的親緣關系

與胚性無直接關系；且廣西本地松果品種(系)多是象牙機、青皮機、呂宋忙或秋枯等的雜交子代或實生后

代。芒果種質資源真偽鑒定的相關文獻資料有：

1、王靜毅等.廣西主要忙果資源遺傳關系的SSR分析[J].熱帶作物學2009,30(9):1301-1307；

2、石勝友，張燕梅.武紅霞，等.36個柿果引進品種的遺傳相似性研究[幾果樹學報2010,27(6):914-917；

3、黃麗芳，雷新濤,姚全勝，等.芒果SSR-PCR反應體系的優化[J].熱帶作物學2010,31(3):410-414；

4、黃麗芳，閆林，范睿，等人.芒果實生資源遺傳多樣性的SSR分析[J].熱帶作物學2011,32(10):1828-1832；

5、羅純，武紅霞,姚全勝，等人.芒果轉錄組中SSR位點信息分析與引物篩選[J].熱帶作物學報

2015,36(7):1261-1266;

6、覃昱茗，張宇，黃國弟，等.忙果SC-SSR分子標記反應體系的建立與優化[J].農業研究與應用，2021,34

(3)：37-43.

7、王明，應東山,王琴飛，等.我國芒果主栽品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J].南方農業學報Journalof

SouthernAgriculture2015,46(7):1154-1159;

8、閆慧清，劉澤標,吉海旺，等.芒果EST-SSR位點分析及引物開發[J].分子植物育種,2020,18(11)

9、周立，羅聰，何堂熹，等.基于EST-SSR標記的芒果品種遺傳多樣性與親緣關系分析[J].分子植物育種.

2020,18(11)

10>PreliminaryHorticulturalStudiesToDescribeAndIdentifyOfTwoNewEgyptianMangoStrainsUsing

DNAFingerprint(利用DNA指紋圖譜描述和鑒定兩個埃及芒果新品系的園藝初步研究)[J].Journalof

AmericanScience,2011,7(2):641-650;

11、A.SennhenneK.Prinz*J.Gebauer*,A.Whitbread?R.Jamnadass?K.Kehlenbeck.Identificationofmango

(MangiferaindicaL.)landracesfromEasternandCentralKenyausingamorphologicalandmolecular

approach(肯尼亞東部和中部芒果地方品種的形態學和分子鑒定)[J].GenetResourCropEvol,2014,61:7-22.

12、ManalEid,M.A.Hussein.EfficiencyParametersofSSRMarkersforCharacterizationofSomeMango

CultivarsandTheirSuitabilityinMolecularBar-codingSSR(標記在芒果品種鑒定中的有效性參數及其在分

子條形碼中的適用性)[J].NewYorkScienceJournal2017;10(8):68-76.

上述這引些研究都表明：SSR標記與毛細管凝膠電泳相結合的分子標記技術可以鑒定芒果品種，可

為芒果的遺傳分析、指紋圖譜構建、雜交效率評定等提供可靠、快速的方法。

2標準起草的主要工作過程

2.1引物的來源

本技術規范編制過程中使用的38對SSR引物主要來源于中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所、

廣西大學農學院、農業部熱帶果樹生物學重點實驗室等科研院所和高校發表的文章中所使用的，以及查

閱其它文獻上使用的芒果基因組序列引物。

2.2芒果品種類型的收集

本實驗收集了20個芒果品種，分別是桂熱芒07-2號、桂熱芒07-3號、桂熱芒08-10號、桂熱芒10-1

號、桂熱芒16-1號、桂熱芒285號、桂熱芒290號、三年芒、PULMER、安寧紅芒、金煌芒、桂熱芒10

號、圣心、桂熱芒82號、桂熱芒60號、桂熱芒4號、泰國芒14號、桂熱芒08-6號、臺農、桂七，其主

要來源于廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所芒果種質資源圃種植基地(南寧市邕武路)。

2.3技術路線與實驗

選取20個廣西區內種植的不同芒果品種。用篩選出的38對SSR引物進行PCR擴增，用聚丙烯酰胺

凝膠電泳檢測，對SSR引物的擴增穩定性及多態性進行分析，并采用毛細管電泳對擴增產物進行同步分

析驗證。

根據峰圖簡單易讀取、多態性高、擴增穩定性高、染色體上分布均勻的原則，最終確定了38對核心

引物用于芒果品種鑒定。

2.4技術驗證

經廣西益譜檢測技術有限公司、廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室和南寧國拓生物科技

有限公司等三家單位，對技術規程的可操作性和檢測數據的可重現性進行了驗證。其中廣西益譜檢測技

術有限公司對20個廣西區內種植的不同芒果品種的38對SSR引物的PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠

電泳檢測驗證；6個廣西區內種植的不同芒果品種的6對SSR引物的PCR擴增產物進行毛細管電泳檢測

驗證。廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室和南寧國拓生物科技有限公司分別對6個廣西區內種

植的不同芒果品種的38對SSR引物的PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測驗證;6個廣西區內種

植的不同芒果品種的6對SSR引物的PCR擴增產物進行毛細管電泳檢測驗證。經驗證，《芒果品種鑒定

技術規程SSR分子標記法》技術規程中的DNA提取、PCR擴增及產物檢測方法具有可操作性，按照技

術規程中的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶明顯，清晰可辯；毛細管電泳檢測方法中擴增的PCR產物均能獲得

清晰、穩定的主峰，且易于識別。

三、標準編制原則和標準的主要內容

1標準編制原則

規范性原則：本技術規范的制定符合法律法規，符合有關標準規范的要求，包括GB/T1.1-2020《標

準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》、NY/T2594《植物品種鑒定DNA分子標記

法總則》、NY/T2440-2013《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南芒果》、GB/T6682《分析實

驗室用水規格和試驗方法》。

適用性原則：本規程的全部內容具有可操作性。

統一性原則：本規程與現行相關標準協調統一，不發生沖突。

先進性原則：本規程采用目前國際國內外品種鑒定領域均認可的、成熟的SSR標記技術，以非變性聚

丙烯酰胺凝膠電泳平臺為主，兼顧毛細管電泳檢測平臺的芒果品種鑒定技術，與田間小區鑒定方法對比,

該方法的先進性在于不受環境影響和季節約束，檢驗周期短?

2標準主要內容

標準編寫主要內容包括樣品處理、聚合酶鏈式反應法（PCR）,聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳操

作過程以及結果判定，適用于芒果種質資源真偽的檢測。

標準規程編制的過程主要進行了以下試驗和工作：

2.1原理

不同品種芒果的遺傳組成不同，其基因組（DNA）中SSR的重復次數存在差異，根據SSR的差異，通

過PCR擴增及電泳技術可以鑒定芒果品種。

2.2樣品來源

樣品采自廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所芒果種質資源圃種植基地(南寧市邕武路)的芒果葉片、

2.3儀器

電子天平、高速冷凍離心機、水浴鍋、PCR擴增儀、垂直板電泳系統、毛細管電泳儀、凝膠成像系

統、膠片觀察燈等。

2.4試劑

液氮、無水乙醇、三氯甲烷、甲醛、三羥甲基氨基甲烷、DNA分子量標準、2XTaqPlusPCR預混

試劑、40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、硝酸銀、硼酸、過硫酸錢、十六烷基三

甲基澳化鍍、乙二胺四乙酸二鈉、四甲基乙二胺、瓊脂糖、去離子甲酰胺、DNA分析儀用丙烯酰胺膠液、

DNA分析儀用LIZ500分子量內標、DNA分析儀用電泳緩沖液、DNA分析儀用光譜校準基質。

2.5SSR引物

引物序列見表1

表1引物編號及引物擴增信息

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列(5'-3')

號(bp)(℃)

正向：CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA

1mangoESll148-24855反向：CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG

正向：CAGTAACTACTACCACCGCAACC

2mangoES24157-27055

反向：ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG

正向：TCCATTTTTGACAAATCTCCACT

3mangoES35156-24655

反向：TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA

正向：GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG

4mangoES39143-16355

反向：CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT

正向：GGGACATTGACTTAACAGCTTTC

5mangoES40144-24455

反向：CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT

正向：CCTGTGCTTACCACCCATATTAG

6mangoES69150-21055

反向：AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA

正向：TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA

7mangoES71125-18055

反向：TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC

正向：CGGGTAAACCCACTATGTATTCC

8mangoES126143-20055

反向：TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA

正向：TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA

9mangoES170150-15855

反向：AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA

正向：TATCATCAGAACTACCGCCATTT

10mangoES172146-19655

反向：CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT

正向：ATTATCCCTATAATGCCCTAT

11EST14175-29050

反向：CTCGGTTAACCTTTGACTAC

正向：AGGACATCTGTGACCAAGAGC

12MCR55170-22058

反向：TTCCCACCCACAACTCCAAC

正向：TGTCTTTCAGCTTCACCGCT

13MCR130250-26058

反向：CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG

正向：CGGGACCATGTCACCAGAAA

14MCR220250-51058

反向：GGCGAATGCGTAGTCAGAGA

正向：ATGGAGACTAGAATGTACAGAG

15Lmmal205-25550

反向：ATTAAATCTCGTCCACAAGT

正向：AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA

16Lmma4240-38047

反向：AAAGACTAATGTGTTTCCTTC

表1引物編號及引物擴增信息(續)

序條帶大小引物退火溫度

引物名稱引物序列(5,-3，)

號(bp)(℃)

正向：AGAATAAGCTGATACTCACAC

17Lmma5280-39047

反向：TAACAAATATCTAATTGACAGG

正向：ATATCTCAGGCTTCGAATGA

18Lmma6105-20550

反向：TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA

正向：ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC

19Lmma7210-25050

反向：AGATTTAGTTTTGATTATGGAG

正向：CATGGAGTTGTGATACCTAC

20Lmma8260-36050

反向：CAGAGTTAGCCATATAGAGTG

正向：TTGCAACTGATAACAAATATAG

21Lmma9205-23047

反向：TTCACATGACAGATATACACTT

正向：TTCTTTAGACTAAGAGCACATT

22LmmalO155-21050

反向：AGTTACAGATCTTCTCCAATT

正向：ATTATTTACCCTACAGAGTGC

23Lmmall240-41049

反向：GTATTATCGGTAATGTCTTCAT

正向：AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA

24Lmmal2210-25047

反向：GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT

正向：CACAGCTCAATAAACTCTATG

25Lmmal3180-23047

反向：CATTATCCCTAATCTAATCATC

正向：AACTACTGTGGCTGACATAT

26Lmmal5220-27050

反向：CTGATTAACATAATGACCATCT

正向：ATAGATTCATATCTTCTTGCAT

27Lmmal6220-25050

反向：TATAAATTATCATCTTCACTGC

正向：CCACGAATATCAACTGCTGCC

28AY942818125-15055

反向：TCTGACACTGCTCTTCCACC

正向：AAACGAGGAAACAGAGCAC

29AY94281990-14053

反向：CAAGTACCTGCTGCAACTAG

正向：AGGTCTTTTATCTTCGGCCC

30AY942820170-23053

反向：AMCGAAAAAGCAGCCCA

正向：TGTAGTCTCTGTTTGCTTC

31AY942821280-41049

反向：TTCTGTGTCGTCAAACTC

正向：AGAATAAAGGGGACACCAGAC

32AY94282323055

反向：CCATCATCGCCCACTCAG

正向：TTGATGCAACTTTCTGCC

33AY942824220-32050

反向：ATGTGATTGTTAGAATGAACTT

正向：CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC

34AY942825240-39053

反向：CGAATACCATCCAGCAAAATAC

正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG

35AY94282624050

反向：ACAGCAATCGTTGCATTC

正向：GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG

36AY942827180-24049

反向：CTTTCATGTTCATAGATGCAA

正向：CTCGCATTTCTCGCAGTC

37AY942828130-29053

反向：TCCCTCCATTTAACCCTCC

正向：GAACGAGAAATCGGGAAC

38AY942829370-50050

反向：GCAGCCATTGAATACAGAG

（一）廣西益譜檢測技術有限公司

表2聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的6個品種芒果與19對引物

芒果品種

序號引物名稱序號引物名稱

名稱

桂熱芒

1AY94281811AY942828

07-3號

桂熱芒290

2AY94282312Lmmal

號

3金煌芒AY94281913Lmmal5

4圣心AY94282014Lmmal3

5臺農AY94282115Lmma9

6桂七AY94282716Lmmal1

7AY94282917Lmmal2

8AY94282418Lmma4

9AY94282519Lmma5

10AY942826

表3聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的20個品種與19對引物

序號芒果品種名稱引物名稱

1桂熱芒07-2號mangoES39

2桂熱芒07-3號mangoES40

3桂熱芒08-10號mangoES126

4桂熱芒10-1號mangoES170

5桂熱芒16-1號mangoES69

6桂熱芒285號Lmma7

7桂熱芒290號LmmalO

8三年芒MCR55

9PULMERmangoES24

10安寧紅芒mangoES35

11金煌芒mangoES71

12桂熱芒10號mangoES172

13圣心MCR130

14桂熱芒82號Lmma6

15桂熱芒60號Lmma8

16桂熱芒4號EST14

17泰國芒14號MCR220

18桂熱芒08-6號Lmmal6

19臺農mangoES11

20桂七

（二）廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室和南寧國拓生物科技有限公

司

表4聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的6個品種與38對引物

芒果品種

序號引物名稱序號引物名稱

名稱

桂熱芒

1AY94281820mangoES11

07-3號

桂熱芒290

2AY94282321mangoES24

號

3金煌芒AY94281922mangoES35

4圣心AY94282023mangoES39

5臺農AY94282124mangoES40

6桂七AY94282725mangoES69

7AY94282926mangoES71

8AY94282427mangoES126

9AY94282528mangoES170

10AY94282629mangoES172

11AY94282830EST14

12Lmmal31MCR220

13Lmmal532MCR55

14Lmmal333MCR130

15Lmma934Lmma6

16Lmmal135Lmma7

17Lmmal236Lmma8

18Lmma437Lmmal0

19Lmma538Lmmal6

一、毛細管電泳

廣西益譜檢測技術有限公司、廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室、

南寧國拓生物科技有限公司均選擇6個芒果品種，6對引物，每個品種分別做6

對引物的毛細管電泳，品種名稱及引物名稱如下表6：

表5毛細管電泳驗證所用的6個芒果品種與6對引物

序號芒果品種名稱引物名稱

1桂熱芒07-3號mangoES39

2桂熱芒290號mangoES126

3金煌芒mangoES172

4圣心Lmmal6

5臺農AY942819

6桂七AY942820

2.6操作步驟

2.6.1樣品采集

用不銹鋼剪刀采集種植的已知品種的芒果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標識，放入0-8℃保溫箱中，

帶回實驗室，于T8℃冰箱中保存備用。

2.6.2DNA的提取

取2.6.1中適量芒果葉片用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎

放入研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，分取lOOmg放入1.5mL離心管中，加入750|JLCTAB提取溶液，

渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min~60min,期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500pL的三氯甲烷，

顛倒混勻，12000rpm離心3min,轉移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積即0.5mL預冷至約4℃

的無水乙醇，顛倒混勻，-18℃冰箱下靜置lh,12000rpm離心3min,去上清，室溫下干燥沉淀。加入

50）JL無菌純水于-18℃中保存備用。

注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達到PCR擴增質量要求的DNA提取方法也適用于本規程。

2.6.3PCR擴增

PCR反應體系

PCR反應體系見表7。

表6PCR反應體系

試劑終濃度體積

滅菌純水-8.5|JL

2xTaqTaqPlusPCR預混試劑1X12.5pL

10pmol/L正向引物0.4pmol/L1.OpL

10pmol/L反向引物0.4pmol/L1.0|jL

25ng/pLDNA模板2.Ong/pL2.0|iL

總體積25.OpL

2.63.2PCR反應程序

94℃預變性5min；94℃變性30s,退火30s（退火溫度見表1推薦引物表），72℃延伸30s,35個循環;

最后72℃下延伸7min。

2.6.4PCR產物檢測

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

.1聚丙烯酰胺凝膠制備

在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1%瓊脂糖溶液，讓其凝固密封。在50mL量杯

中依次力口入7.5mL5xTBE緩沖液，7.5mL40%Acryl/BisSolution（29:1）,攪拌并用純凈水定容至30mL；加

入200HL10%過硫酸錢和12HL四甲基乙二胺溶液，混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在

50min~60min內聚合凝固，凝膠高度應不小于10cm。

.2電泳

將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液，小心拔下樣品梳。用加樣器吸取WL不

同引物（表1）PCR產物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1）JLDNAmarker。電泳選用的電壓梯度

為卜5V/cm,2xTaqPlus預混試劑的藍色指示帶從上到下分別到達膠板1/2、2/3處（大約lh）后結束電泳。

.3銀染顯色

將附著凝膠的玻璃板用去離子水沖洗30s~60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中，加入染色液覆蓋凝膠,

輕搖5min~10min進行染色；倒掉染色液，用去離子水快速漂洗，放入顯色液中，輕搖至顯色出清晰帶紋:

取出凝膠用去離子水沖洗兩遍，瀝干后進行拍照。

2.6A.2毛細管電泳檢測

.1PCR產物樣品準備

分別取等體積的稀釋后不同引物（表5）PCR擴增產物溶液混合，從混合液中吸取WL按序號加入到

DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入O.IRLDNALIZ500分子量內標和8.9pL去離子甲酰胺。

將樣品在PCR儀上95℃變性5min,取出，迅速置于碎冰塊上，冷去fJ10-15min。將整個96孔板置于離心機中，

離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。

2.6A.2.2電泳檢測

按照儀器操作規程，編輯樣品表及運行程序，執行運行程序，儀器自動給出檢測結果，保存并記錄

數據。

2.7數據記錄與統計

樣品每個SSR位點的等位變異采用擴增片段長度的形式表示。對于毛細管電泳檢測方法，通過使用對

照品種，消除同型號不同批次間或不同型號DNA分析儀間可能存在的系統誤差，使用片段分析軟件讀取

待檢樣品在該位點的等位變異。對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，將每個擴增位點的等位變異

與相應的對照品種的等位變異片段大小進行比較，確定待檢樣品在該位點的等位變異。

純點結合的等位變異大小數據記為X/X,其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異大小

數據記錄為X/Y,其中X、Y分別為該位點上的2個等位變異的大小，小片段數據在前、大片段數據在后。

缺失位點在等位變異大小數據記錄為0/0。

示例1：樣品在某個位點上僅出現1個等位變異，大小為160bp,則該位點的等位變異數據記錄為

160/160-

示例2：樣品在某個位點上僅出現2個等位變異，大小為160bp、165bp,則該位點的等位變異數據記

錄為160/165。

2.8判定方法

當待檢樣品和對照品種間差異位點數22,則判定為“不同品種,"；當待檢樣品和對照品種間差異

位點數=1,判定為“近似品種”：當樣品間差異位點數=0,判定為“極近似品種或相同品種”。

2.9結果與記錄

2.9.1用瓊脂糖凝膠檢測毛細管電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果見附件原始記錄圖譜。

廣西益譜檢測技術有限公司結果原始記錄圖譜（見附件1）

廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室結果原始記錄圖譜（見附件2）

南寧國拓生物科技有限公司結果原始記錄圖譜（見附件3）

四、制定標準的原則和依據，與現行法律、法規的關系，與有關國家標準、行業標準的協調

情況。

本標準的編制依據現行的法律、法規和國家強制性標準，與這些文件中的規定不存在矛盾，協調一

致。

五、重大意見分歧的處理結果和依據

無

六、提出標準強制實施或推薦實施的建議和理由

本項標準的制訂，已經實驗室的驗證，可作為推薦性地方標準，用于芒果種質資源真偽的檢測。

廣西地方標準《芒果品種鑒定技術規程SSR分子標記法》編寫組