基因工程

GeneticEngineering最新款的摩托車誰能告訴我這是ＷＨＡＴ？誰能告訴我這是ＷＨＡＴ？香蕉魚家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮青霉菌能產生對人類有用的抗生素——青霉素定向基因改造設想設想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細菌“吐出”蠶絲？設想二能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設想三經過多年的努力，科學家于20世紀70年代創立了可以定向改造生物的新技術——基因工程。現代生物工程技術蛋白質工程細胞組織工程酶工程

發酵工程

基因工程基因工程

概論

Introduction相關理論DNA結構與復制基因的相關概念基因組DNA分子組成：堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)脫氧核糖磷酸（一）DNA的結構(A)腺嘌呤(G)鳥嘌呤(C)胞嘧啶(U)尿嘧啶(T)胸腺嘧啶DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替，彼此通過3/,5/-磷酸二酯鍵連接，排在外側，構成基本骨架；4種堿基排列在內側。DNA的結構.兩條脫氧核苷酸鏈成反向平行排列，.一條呈5’3’方向.另一條呈3’5’方向。.以堿基配對形成氫鍵而形成雙螺旋結構.遵循互補配對原則即：

A＝TG≡C雙螺旋結構(T)胸腺嘧啶DNA的三種構型：

-超螺旋：共價閉環（CCC）

-開環：單鏈缺口（OC）

-線型：雙鏈斷裂（L）LC

cccocDNA的性能吸收光譜高峰為260nm

溴化乙啶（EB）嵌入DNA雙鏈配對堿基之間，紫外線照射，可顯示DNA位置在電場中的遷移率與分子量大小、構象有關DNA變性：在物理或化學因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過程DNA復性：變性因素去除后在適當條件下恢復成雙鏈的過程。

DNA變性(DNADenature)

指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為單鏈線性結構的現象。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素，均可引起核酸分子變性。解鏈溫度:Tm=69.3＋0.41(%G+C)

（使一半螺旋結構解體時的溫度）

DNA復性

(DNARenature)是DNA變性的一種逆轉過程。熱變性后的DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。最佳復性條件一般認為是比Tm低25℃左右的溫度復性時溫度下降必須緩慢，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。復性RNADNADNA的復制半保留復制（semi-conservativereplication）

（二）基因的概念遺傳學概念：

基因:

是DNA分子中攜帶特定遺傳信息的最小功能單位，控制遺傳性狀

轉錄剪切翻譯

分子生物學定義：編碼功能性蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列，負載特定的遺傳信息并在一定條件下調節、表達遺傳信息，指令蛋白質合成。

翻譯復制復制轉錄反轉錄DNARNA蛋白質中心法則基因的功能分類結構基因（structuregene)：決定蛋白質/多肽鏈或酶分子結構的基因調控基因(regulatorygene)：調節控制結構基因表達功能基因的一般特性半保留自我復制決定生物表型或性狀基因突變

新的生物性狀（三）基因組（genome)概念：細胞或生物體的全套遺傳物質常見基因組特點：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組人類基因組1.病毒基因組基因組小，基因數少帶有重疊基因大部分為編碼蛋白質的結構基因HBV基因組

2原核生物基因與表達特點

——細菌基因表達

1）基因組較小2）基因是連續的3）沒有轉錄后加工過程

和翻譯后加工過程。4）轉錄和翻譯偶聯，可同時進行。2.原核生物基因組細菌染色質質粒（plasmid）：

細菌染色體以外的遺傳物質，是環狀閉合的雙鏈DNA。可自主復制編碼生物學形狀基因工程常用載體

細菌質粒示意真核生物基因組基因組龐大3×109bp、染色質、染色體.基因不連續性斷裂基因、內含子、外顯子（大部分基因含有內含子）含有大量重復序列非編碼區域多于編碼區域

非編碼區較多；多于編碼序列(9:1）轉錄和翻譯不偶聯人類基因組細胞核基因組（nucleolusgenome)線粒體基因組(mitochondrialgenome)細胞核基因組人類單倍體基因組3.2x109bp，編碼1.5X106種蛋白結構基因僅約3萬個，占總基因組的2-3%.多為單基因序列(60-65%，如編碼蛋白或酶的基因)，其他為基因間的間隔序列、插入序列、重復序列。基因家族：來源相同、結構相似、功能相關的基因，如HLAsystemA-C-B-D-DR-DQ-DP基因側翼的短序列：啟動子、增強子、原癌基因等調控序列線粒體基因組：人類線粒體DNA(mtDNA)是獨立于核染色體以外的基因組，為環狀雙聯DNA。主要編碼與細胞呼吸鏈代謝相關的蛋白和酶人類線粒體基因組排列緊湊，有重疊，除mtDNA復制與轉錄相關的區域外，無內含子。

mtDNA任何突變均可累及基因組內某些功能區域，近年研究發現，線粒體基因突變與臨床某些疾病有關。如肌陣顫性癲間

第一節基因工程的概念基因工程（geneticengineering）基因工程是現代分子生物學技術的重要組成部分,是20世紀70年代初發展起來的一門新興技術,它標志著人類已進入控制遺傳形狀的新時代.遺傳工程是按照人們預先設計的藍圖，將一種生物的遺傳物質繞過有性生殖導入另一種生物中去，使其獲得新的遺傳性狀，形成新的生物類型的基因操作（geneticmanipulation）。

廣義的遺傳工程包括細胞工程和基因工程，狹義的遺傳工程就是指基因工程.

基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基因或基因組提取出來,或者人工合成的基因,按照人們的愿望,進行嚴密的設計,經過體外加工重組,通過一定的方法,轉移到另一種生物體(受體)的細胞內,使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術.基因工程(geneticengineering)常和以下名稱混用:基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(recombinationDNAtechnique)經典定義重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。根據目的及產物的不同，基因工程分為：基因克隆：在基因水平上，根據人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，并將重組DNA轉入受體細胞進行無性繁殖。基因表達：在基因水平上，根據人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，并將重組DNA轉入受體細胞表達目的蛋白并行使正常功能。

第二節基因工程的誕生與發展基因工程誕生的基礎

（一）理論上的三大發現（二）技術上的三大發明基因工程的誕生基因工程的發展（一）基因工程的艱難階段（二）基因工程的逐漸成熟階段（三）基因工程的迅速發展階段（一）理論上的三大發現（1）DNA是遺傳物質1944Avery細菌轉化實驗證明：DNA是遺傳物質意義：DNA可以從一個細菌轉移到另一個細菌，從而把遺傳性狀傳遞過去。這項工作是現代生物科學的革命性開端和基因工程的先導（引自諾貝爾獎獲得者Lederberg之語）。細菌轉化實驗細菌轉化實驗細菌轉化實驗細菌轉化實驗細菌轉化實驗（一）理論上的三大發現（2）DNA雙螺旋模型

1953Watson/Crick提出了DNA雙螺旋結構模型；隨后證明了DNA半保留復制的機理，解決了基因的自我復制和傳遞的問題；

意義：對生命科學的發展作用可與達爾文學說媲美，與孟德爾定律齊名。從而使遺傳學的研究全面進入分子遺傳學階段．DNA雙螺旋脫氧核糖和磷酸基通過酯鍵交替連接成反向平行的兩條主鏈，它們繞一共同軸心向右盤旋形成雙螺旋構型。形成大溝和小溝。，螺旋直徑2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相鄰堿基對平面的間距0.34nm。DNA雙螺旋堿基位于螺旋的內則，它們垂直于螺旋軸。磷酸和戊糖位于外側，彼此間通過磷酸二酯鍵連接，形成DNA的骨架，糖環平面與中軸平行。DNA雙螺旋同一平面的堿基在二條主鏈間形成堿基對。A-T、G-C。間以氫鍵配對。A-T間形成兩個氫鍵，G-C間形成三個氫鍵。DNA雙螺旋確定了遺傳信息傳遞的方式

1961年Monod和Jacob提出了操縱子學說；1964年Nirenberg等提出了“三聯體密碼說”；Crick提出了遺傳信息流向和表達的中心法則

這三大發現大大促進了生命科學的迅速發展，為基因工程的誕生奠定了重要的理論基礎．

（一）理論上的三大發現（3）中心法則密碼子表（二）技術上的三大發明DNAligase(glue):1967Restrictionenzyme(scissors):1970Geneticengineeringvector:1973（二）技術上的三大發明（1）限制性核酸內切酶的發現與DNA的切割分子剪刀和DNA縫合工具，奠定了基因工程誕生的最重要的技術基礎。Smith和Wilcox（1970）在流感嗜血桿菌中分離純化了限制性內切酶HindII；Boyer實驗室（1972）發現核酸內切酶EcoRI。（二）技術上的三大發明（2）DNA連接酶的發現與DNA片段的連接1967發現DNA連接酶1970Khorana實驗室發現T4噬菌體DNA連接酶1972建立雙鏈DNA的連接方法（二）技術上的三大發明（3）基因運載工具—DNA載體的使用染色體外的遺傳因子細菌的性因子—F因子Lederberg1946抗藥性因子（R）大腸桿菌素因子（COE）質粒Cohen1973二基因工程的誕生第一個重組DNA分子和重組的生物體1972P.Berg美國斯坦福大學把SV40的DNA和λPhageDNA分別切割，又將兩者連在一起，成功地構建了第一個體外重組的人工DNA分子。1973Cohen等將體外重組的分子導入大腸桿菌中，進行無性繁殖，完成了體外DNA重組和擴增的全過程。首次克隆轉化成功。

1973年為基因工程元年。三、基因工程的發展基因工程的艱難階段關于基因工程的爭議從1972年到1976年，人們對DNA重組所涉及的載體和受體系統進行了有效的安全性改造，包括噬菌體DNA載體的有條件包裝以及受體細胞遺傳重組和感染寄生缺陷突變株的篩選，建立了一套嚴格的DNA重組試驗室設計與規范操作。三、基因工程的發展基因工程的逐漸成熟階段1977年，日本科學家首次在大腸桿菌中克隆并表達了人生長激素釋放抑制素基因，首次實現真核基因的原核表達。隨后，美國的Ullvich克隆并在大腸桿菌中表達了人胰島素基因。1978年，美國Genentech公司開發出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的生產工藝。三、基因工程的發展迅速發展階段1982利用顯微注射法培育轉基因小鼠1983利用農桿菌介導法培育轉基因煙草1990美國政府批準對一名因腺苷脫氨酶基因缺陷而患有重度聯合免疫缺陷癥的兒童進行基因工程治療，獲得成功。1991人類基因組計劃啟動1986-1998，共有4387項轉基因植物批準進入田間試驗。1997克隆羊“多莉”誕生。克隆羊“多莉”第三節基因工程研究的主要內容基因工程研究的主要內容基礎研究:basicresearch克隆載體研究:cloningvector受體系統的研究:hostcellsystem目的基因的研究:targetgene生物基因組學的研究:genomicresearch應用研究:application第三節基因工程研究的主要內容基因工程的基本操作程序分離獲得目的基因限制性核酸內切酶將切割外源DNA和載體DNA連接酶將外源DNA和載體連接，組成重組DNA分子。將重組DNA分子引入受體細胞帶有重組體的細胞培養擴增，獲得大量的細胞繁殖群體篩選和鑒定轉化細胞進一步研究分析，實現功能蛋白的表達ThefourstepsinagenecloningGenerationofDNAfragmentsJoiningtoavectororcarriermoleculeIntroductionintoahostcellforamplificationSelectionofrequiredsequence細菌基因工程第四節基因工程的意義與

發展前景意義大規模生產生物分子設計、構建新物種搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內的遺傳資源發展前景1、基因工程與作物育種Goldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.html轉2個水仙花和1個細菌VA合成酶基因的水稻“金米”（AntifreezeProteinsAFPs)避免細胞結冰有助植物抗凍抗凍糖蛋白無冰晶細菌幫助草莓抗霜凍降低原生質冰點抑制冰晶重結晶修飾冰晶形態調節原生質膠體性質抗蟲轉基因植物生長快、肉質好的轉基因魚(中國)乳汁中含有人生長激素的轉基因牛(阿根廷)轉黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉魚抗寒基因的番茄

2、基因工程與藥物研制我國生產的部分基因

工程疫苗和藥物

許多藥品的生產是從生物組織中提取的。受材料來源限制產量有限，其價格往往十分昂貴。

微生物生長迅速，容易控制，適于大規模工業化生產。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產生相應的藥物，不但能解決產量問題，還能大大降低生產成本。

胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。

將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養液就能產生100g胰島素！使其價格降低了30%-50%!

轉基因抗乙肝西紅柿(中國)，雖然不能治愈乙肝，但一年只吃幾個抗乙肝西紅柿，就完全能代替注射乙肝疫苗。抗乙肝西紅柿屬于轉基因食品，就是將乙肝疫苗植入西紅柿內，經過多代繁殖，使轉入的基因穩定化。用轉基因的植物生產藥物

基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環境的物質。

通常一種假單孢桿菌只能分解石油中的一種烴類．用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。

科學家還培育出能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質的細菌。3、環境污染治理

轉基因食品

安全嗎?!轉基因植物的安全性爭論支持派認為：如果轉基因農業生物技術得不到社會支持，這一研究將被扼殺，并且強調，迄今為止并沒有發現轉基因食品危害人體健康和環境的確切證據。美國人食用轉基因食品已多年，超級市場上有4000多種商品是含有轉基因植物成分的，還沒有事例證明人吃了以后會得病，甚至會引起死亡。

加拿大、澳大利亞也是轉基因食品的生產大國，均有幾千萬人在吃，到現在為止也沒有—個案例說明它有問題。反對派的觀點一英國科學家聲稱，轉基因馬鈴薯會減弱老鼠免疫系統功能；美國康乃爾大學也發現，轉基因玉米會危害蝴蝶幼蟲及其相關生態環境。環保團體認為這種違反自然的轉基因作物及產品，未經長期安全測試，長期食用可能對人類及生態環境造成負面影響。尤其是注重環境和生態保護的歐盟國家，對轉基因作物更加排斥，因而抵制美國GMO產品的進口。

國外轉基因植物產業化現狀

植物細胞的全能性為植物的細胞、組織培養及植物基因轉化提供了前提條件.在植物組織培養基礎上發展起來的一系列將外源基因導入植物細胞的遺傳轉化技術已基本成熟.

植物轉基因技術是指把從動物、植物或微生物中分離到的目的基因,通過各種方法轉移到植物的基因組中,使之穩定遺傳并賦予植物新的農藝性狀,如抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等.1983年世界上第一例轉基因植物在美國成功培植,標志著植物轉基因技術的正式誕生.至今已有35科120多種植物轉基因獲得成功.目前,一個完整的植物基因工程的理論和技術體系已基本建立,開始走向商業化.1986年首批轉基因植物被批準進入田間試驗,至今國際上已有30個國家批準千例轉基因植物進入田間試驗,涉及的植物種類達40多種.1994年美國Calgene公司研制