ICS07.080

A20/39

中華人民共和國國家標準

GB/T╳G╳B/╳T╳╳-╳201╳

金屬螯合層析介質

Metalchelatingchromatographicmedium

（征求意見稿）

（草案）

200×-××-××發布200×-××-××實施

中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局

中國國家標準化管理委員會

1

2

金屬螯合親和層析介質

1范圍

本標準規定了金屬螯合層析介質的技術要求、檢測方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸

和貯存。

本標準適用于骨架為瓊脂糖微球的金屬螯合層析介質的生產與檢測。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本

適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

3術語與定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1金屬螯合層析介質metalchelatingchromatographicmedium

將亞氨基二乙酸（IDA）或者次氮基三乙酸（NTA）鍵合在高流速瓊脂糖微球上，再螯

合金屬離子Ni2+（或其它金屬離子）而形成的一類層析介質。

4技術要求

4.1外觀

在光學顯微鏡下球形飽滿，表面光滑，透明性良好。

4.2理化性質

金屬螯合親和層析介質的理化性質應符合表1中的規定。

表1金屬螯合層析介質的主要性能參數

檢測項目技術指標

3

粒度范圍/(45.00μm~165μm)

%≥90

平均粒徑（μm）99.00±11.00

IDA（μmolNi2+/mL）≥36

配基密度

NTA（μmolNi2+/mL）≥15.00

IDA（mgHis-taggedLDH/mL）≥40.00

動態載量

NTA（mgHis-taggedLDH/mL）≥40.00

在0.1Mpa壓力下可達最高流速*（cm/h）≥270

微生物污染（菌落數/mL懸浮液）<100

pH3≤0.16

IDA

化學穩定pH13≤0.16

脫落物（羥甲基糠醛）測定，%

性pH3≤0.25

NTA

pH13≤0.25

*：層析柱Φ1.60cm×20.00cm(介質床層高度10.00cm),溫度22℃（±3℃）,溶液為H2O的

條件下測定。

5試驗方法

本方法中所用的水，在未注明其他要求時，應符合GB/T6682中二級水的規格，所用試

劑，在未注明其他規格時，均指分析純（AR）。

5.1外觀

5.1.1儀器

5.1.1.1光學顯微鏡。

5.1.1.2真空泵：極限真空0.1MPa。

5.1.2測定步驟

5.1.2.1樣品處理

用量筒量取5mL金屬螯合層析介質，置于50mL砂芯漏斗中。用去三級水清洗5次每次2

min，抽干5min。將洗凈的介質置于燒杯中，介質上應有2cm的三級水。混勻后得到金屬螯

合層析介質與水的混合體系。

5.1.2.2樣品觀測前處理

4

用塑料吸管吸取1mL金屬螯合層析介質與水的混合體系置于載玻片上，調整顯微鏡放

大倍數。以視野里80%以上面積均為微球為標準，用塑料吸管增減載玻片上的微球，最后用

蓋玻片壓上。

5.1..3樣品觀測

調節光學顯微鏡焦距，使視野中的影像清晰。拍攝瓊脂糖白球照片并保存。

5.2粒徑及其分布

5.2.1儀器

5.2.2.1激光粒度儀。

5.2.2.2塑料吸管。

5.2.2.3玻璃濾瓶。

5.2.2.4砂芯漏斗（G3）。

5.2.2.5真空泵：極限真空0.10MPa

5.2.2測定步驟

5.2.2.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.2.2.2樣品檢測

設置測量顆粒類型為通用型，分散劑類型為水，分析模式為單峰模式，添加樣品進行測

定。

5.2.4結果表示

通過激光粒度儀的檢測結果包括平均粒徑值及其分布圖，根據粒徑分布（如圖1中表格）

按公式（1）計算45-165μm粒徑范圍內微球數量所占百分比。

……（1）

式中：

W粒徑——45-165μm粒徑范圍內微球數量所占百分比（%）；

W1，W2，……Wx——符合45-165μm范圍的各粒徑范圍百分比，例如圖2中

45.709μm-52.481μm的球所占百分比為3.08%。

5

圖2金屬螯合層析介質粒徑分布圖

平均粒徑的計算方法：

其中dBk為單個介質的粒徑，為所統計的一定數量乳液滴的平均值，N為所

統計的乳液滴的數目。

5.2.5允許差

同一試樣三次測定結果之差，應不超過平均值的5%。

5.3配基密度(金屬離子(Ni2+)密度)測定

5.3.1儀器

5.3.2.5層析柱：Φ1.00cm×20.00cm。

5.3.2.6滴定管。

5.3.2溶液配制

5.3.3.1氨-氯化銨緩沖液甲，pH10

將氯化銨68.00g溶于蒸餾水300mL，加濃氨水570mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。

5.3.3.2氨-氯化銨緩沖液乙，pH10

稱取氯化銨5.40g，加水50mL溶解后，加35mL濃氨水，最后用定容至100mL。

5.3.3.35g/L鉻黑T指示液

0.50g鉻黑T加鹽酸羥胺4.00g溶于100mL乙醇中。

5.3.3.4紫脲酸胺指示劑

稱取紫脲酸胺1.00g，加氯化鈉100.00g于研缽內研成粉狀，裝入棕色干凈的廣口瓶

6

中備用。

5.3.3.5EDTA標準溶液（CEDTA=0.l0mol/L）

5.3.3.5.1配制

稱取40.00g乙二胺四乙酸二鈉，加熱溶于1000mL水中，冷卻，搖勻。

5.3.3.5.2標定

稱取0.25g于800℃灼燒至恒重的基準氧化鋅，稱準至0.0001g。用少量水濕潤，加

5mL20%的鹽酸溶液使樣品溶解，加10mL水，用10%氨水溶液中和至pH7~8，加10mL

氨-氯化銨緩沖液甲(pH=10)及5滴5g/L鉻黑T指示液，用配制好的乙二胺四乙酸二鈉溶液

滴定至溶液由紫色變為純藍色。同時作空白試驗。

5.3.3.5.3計算

根據公式(1)計算乙二胺四乙酸二鈉標準溶液濃度:

m

C=

EDTEV-V′

(12)0.08138……(1)

式中:

CEDTA——乙二胺四乙酸二鈉標準溶液之物質的量的濃度（mol/L）；

m——氧化鋅之質量（g）；

V1——乙二胺四乙酸二鈉溶液之用量（mL）；

V2——空白試驗用乙二胺四酸二鈉之用量（mL）；

0.08138——與1.00mL乙二胺四乙酸二鈉標準溶液(CEDTA=1.000mol/L)相當的以克為

單位表示的氧化鋅的質量。

5.3.4測定步驟

5.3.4.1樣品處理

用量筒量取5mL金屬螯合層析介質，置于50mL砂芯漏斗中。用三級水清

洗5次每次2min，再用0.1mol/LEDTA溶液清洗5次每次5min將介質上螯合

的金屬離子清洗凈，最后用三級水清洗5次每次2min，抽干5min。

5.3.4.2裝柱

稱取2.00g抽干的偶聯IDA(或NTA)配基的瓊脂糖微球(螯合金屬離子前)，將其與水的

混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩定。柱子上端充滿水，放入上篩

板。打開柱子入口，連續向柱中通入三級水（10個柱體積），保持床層穩定。

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5.3.4.2樣品檢測

準確量取50mL標定的0.05mol/L的Ni(NO3)2·6H2O溶液，勻速通過柱內，立即收集

流出液；用去離子水洗滌珠體表面未被吸附的Ni2+離子，同時收集流出液，同上步收集的流

出液混合。

5.3.4.3滴定

反應后的Ni(NO3)2溶液用氨水調節pH值至7~8，加入50mL氨-氯化銨緩沖液乙，0.25g

紫脲酸胺指示劑，用0.1mol/L的EDTA標準溶液進行滴定至溶液由黃色變為紫色為終點。

記錄所消耗的EDTA標準溶液的體積，進行計算。

5.3.4.4計算

根據公式(2)計算濕膠Ni2+的螯合量：

′-

2+CEDTA(VEDTA,0VEDTA,1)

CN=′1000……(2)

W′1.42

式中，

2+2+

CN——濕膠Ni的螯合量（μmol/ml）；

CEDTA——EDTA標準溶液的濃度（mol/L）；

VEDTA,0——反應前的Ni(NO3)2溶液消耗EDTA標準溶液的體積（mL）升；

VEDTA,1——反應后收集到的Ni(NO3)2溶液消耗EDTA標準溶液的體積（mL）；

W——稱量的樣品質量（g）；

1.42——1g濕膠的體積為1.42mL。

5.3.5允許差

同一試樣三次測定結果之差，應不超過平均值的5%。

5.4動態載量

5.4.2儀器

5.4.2.1中低壓蛋白層析系統。

5.4.2.2紫外分光光度計。

5.4.2.3pH計。

5.4.2.4層析柱：Φ1.00cm×20.00cm

5.4.2.5過濾裝置。

8

5.4.2.6微濾膜：0.45μm。

5.4.2.7真空泵：極限真空0.10MPa。

5.4.3溶液配制

5.4.3.1BufferA：20mMPB+0.1MNaCl+50mM咪唑，pH7.4

準確稱取5.80gNa2HPO4·12H2O、0.59gNaH2PO4·2H2O、5.84gNaCl和3.40g咪唑，

用去離子水溶解定容至1000mL，用1MNaOH或1MHCl調節pH至7.4，過濾（膜孔徑

0.45μm）。

5.4.3.2BufferB：20mMPB+0.1MNaCl+0.5M咪唑，pH7.4

準確稱取2.90gNa2HPO4·12H2O、0.29gNaH2PO4·2H2O、2.92gNaCl和17.02g咪唑，

用去離子水溶解定容至500mL，用1MNaOH或1MHCl調節pH至7.4，過濾（膜孔徑0.45

μm）。

5.4.3.3His-taggedLDH溶液

準確稱取300mgHis-taggedLDH凍干粉（用純水透析后凍干），溶解于100mLBufferA

中，濃度為3mg/ml，過濾（膜孔徑0.45μm）。

5.4.4測定步驟

5.4.4.1樣品處理

方法同本標準5.1.3.1。

5.4.3.3裝柱

將介質與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩定（Φ1.60

cm×5.00cm），柱子上端充滿水。打開柱子入口，連續向柱中通入三級水（10個柱體積），

保持床層穩定。

5.4.3.4動態載量測定

將層析柱連在層析系統中，對載量測定過程進行監控。用BufferA以1mL/min流速平

衡層析柱10個柱體積(CV)，以預純化的His-taggedLDH溶液（蛋白濃度3.0mg/ml）上樣，

流速2mL/min，待紫外信號達到原料紫外吸收值的50%后停止上樣，再用BufferA淋洗至

基線，再用BufferB洗脫，收集洗脫峰。用純水沖洗徹底置換出BufferB，然后用20%乙醇

溶液沖洗，保存層析介質。

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圖3金屬螯合層析介質載量測定層析譜圖

5.4.5結果計算

以柱出口蛋白濃度C與入口蛋白濃度C0之比值C/C0與流出液體積作圖，即介質的穿透

曲線。以柱出口蛋白濃度C達到入口蛋白濃度C0的50%時，介質的吸附容量為介質的動態

載量，根據公式(3)計算:

…………(3)

式中：

Q50%——介質的動態載量（mg/mL）；

C0——蛋白起始濃度（mg/mL）；

V1——柱出口蛋白濃度C達到入口蛋白濃度C0的10%時流出液體積（mL）；

V0——管路的死體積（mL）；

Vgel——介質體積（mL）。

5.4.6允許差

同一試樣三次測定結果之差，應不超過平均值的10%。

5.5耐受壓力強度測試

5.5.2儀器

5.5.2.1中低壓層析系統。

5.5.2.2玻璃層析柱：Φ1.60cm×20.00cm。

5.5.2.3玻璃濾瓶。

10

5.5.2.4砂芯漏斗（G3）。

5.5.2.5真空泵：極限真空0.10MPa。

5.5.3測定步驟

5.5.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.5.3.2樣品裝柱

將介質與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩定（Φ1.60

cm×10.00cm），柱子上端充滿水。打開柱子入口，向柱中通入一定體積去離子水（10個柱

體積左右），保持床層穩定。

5.5.3.3樣品測定

將層析柱連入中低壓層析系統。測定時，從零開始設定一定流速Vx（mL/min），保持

該流速5min后，記錄此時柱壓Px(MPa)。繼續增加流速，并測定相應流速下的柱壓。直到

壓力達到0.10Mpa為止。

5.5.4結果表示

按公式（4）計算線速度。以線速度與壓力之間的關系作圖，由圖讀取最大流速（如圖

3）。

…………（4）

式中：

V——線速度（cm/h）；

Vx——流速（mL/min）；

S——層析柱截面積（cm2）。

11

圖4金屬鰲合層析介質壓力-流速曲線

5.5.5允許差

同一試樣三次測定結果之差，應不超過平均值的10%。

5.6微生物污染

5.6.3測定步驟

5.6.3.1樣品前處理

在空培養皿底部標記樣品名稱。按照（GBT5475-2013離子交換樹脂取樣方法）直接

從產品中抽取5mL樣品，置于50mL砂芯漏斗中抽干5min。取1mL抽干介質，加入1mL

三級水，采用旋渦混合器混勻樣品。將含有30mL胰蛋白胨大豆瓊脂培養基的錐形瓶進行高

溫滅菌（121°C，20min），待培養基冷卻到40°C時，用微量移液器吸取1mL混勻后的樣

品加入到該錐形瓶中，緩緩混合，把混合物倒入培養皿中，蓋好上蓋。

5.6.3.2凝固混合物

在室溫下使混合物凝固。

5.6.3.3孵育

把培養皿置于恒溫箱中孵育。在孵育期間培養皿需要倒置，在35℃中放置5天。

12

5.6.4結果表示

孵育期后檢查培養皿。計數菌落形成單位數（CFU），估計每毫升樣品中微生物的數量。

5.6.5允許差

同一試樣三次測定結果之差，應不超過5。

5化學穩定性

5.7.1試劑與材料

5.7.1.9標準物質：羥甲基糠醛純度≥99%。

5.7.1.10標準儲備溶液：準確稱取適量的羥甲基糠醛標準物質于100mL容量瓶，用10mL

甲醇溶解，定容，配成0.20mg/mL的標準儲備液。此溶液可在溫度低于4℃冰箱中冷藏保存

兩個月。

5.7.1.11標準工作溶液：分別吸取適量的羥甲基糠醛標準儲備溶液至100mL容量瓶中，用

10%甲醇溶液稀釋至刻度，配成0.01μg/mL，0.03μg/mL，0.05μg/mL，0.08μg/mL，0.10μg/mL，

0.20μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，6.0μg/mL，10μg/mL標準工作溶液。當天新

鮮配制。

5.7.2儀器

5.7.2.1帶蓋玻璃試管。

5.7.2.2玻璃濾瓶。

5.7.2.3砂芯漏斗（G3）。

5.7.2.4真空泵：極限真空0.10MPa。

5.7.2.5旋轉蒸發儀。

5.7.2.6高效液相色譜儀：配有紫外檢測器。

5.7.2.7注射器：10mL。

5.7.2.8過濾膜：0.45μm。

5.7.3測定步驟

5.7.3.1樣品處理

13

方法同5.1.3.1。

5.7.3.2將樣品置于不同pH溶液中培養

取若干份1.00g抽干白球置于帶蓋玻璃試管內。將上述pH3-13的溶液各10mL分別置

于各試管內，平行實驗三次。樣品管在40°C條件下培養7天。7天后，上層清液被轉移到

干凈的試管內。

5.7.3.3上機前樣品處理

上層清液經旋轉蒸發（60℃，50轉/分），定容至2mL，加入等體積12M鹽酸，100℃

水解1h。定容至5mL。另取1.00g抽干白球，加入4mL6M鹽酸，100℃水解1h。定容至

5mL。用0.45μm的濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測器測定。

5.7.3.4色譜測定

1）液相色譜條件

a）色譜柱：DiamonsilC185μm，250mm×4.6mm（i.d.）或相當者；

b）流動相：甲醇+水（10+90）；

c）流速：1.0mL/min；

d）檢測波長：285nm；

e）柱溫：30℃；

f）進樣量：10μL。

2）液相色譜測定

首先測定標準工作溶液在上述色譜條件下的峰面積，以峰面積對相應濃度繪制標準工作

曲線，然后測定未知樣品，用標準工作曲線對樣品進行定量。樣品溶液中羥甲基糠醛的響應

值應在儀器的線性范圍a內。在上述色譜條件下，羥甲基糠醛的參考保留時間為9.79-10.40min

范圍內，保留時間隨樣品濃度變化而變化濃度越低保留時間越小。羥甲基糠醛標準物質色譜

圖和含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖參加圖。

a

14

b

圖5羥甲基糠醛標準物質色譜圖（其中a為濃度0.01mg/L，b為濃度10mg/L）

圖6含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖

3）空白試驗

除不加樣品試液外，均按上述步驟進行。

5.7.4結果

上清液中的羥甲基糠醛的含量按下式計算獲得，計算結果應扣除空白值。

…………（6）

式中：

X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量（mg/L）；

c——從工作曲線求得的試樣溶液中羥甲基糠醛的含量（mg/L）；

V——試樣最終的定容體積（mL）；