紫外分光光度計的使用原理和方法

紫外-可見吸收光譜朗伯-比耳定律紫外-可見分光光度計分析條件的選擇測定方法在醫學檢驗中的應用1精品PPT|實用可編輯第一頁，共五十一頁。紫外-可見分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)

按所吸收光的波長區域不同，分為紫外分光光度法和可見分光光度法，合稱為紫外-可見分光光度法。它是利用物質的分子或離子對某一波長范圍的光的吸收作用，對物質進行定性分析、定量分析及結構分析,所依據的光譜是分子或離子吸收入射光中特定波長的光而產生的吸收光譜。2精品PPT|實用可編輯第二頁，共五十一頁。紫外-可見分光光度法的特點：

1與其它光譜分析方法相比，其儀器設備和操作都比較簡單，費用少，分析速度快;2靈敏度高;3

選擇性好;4精密度和準確度較高;5用途廣泛。

3精品PPT|實用可編輯第三頁，共五十一頁。§1.紫外-可見吸收光譜

1.物質對光的選擇性吸收

物質對光的吸收是選擇性的，利用被測物質對某波長的光的吸收來了解物質的特性，這就是光譜法的基礎。4精品PPT|實用可編輯第四頁，共五十一頁。通過測定被測物質對不同波長的光的吸收強度（吸光度），以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得出該物質在測定波長范圍的吸收曲線。如圖3-1；在吸收曲線中，通常選用最大吸收波長λmax進行物質含量的測定。

5精品PPT|實用可編輯第五頁，共五十一頁。2有機化合物的紫外-可見吸收光譜與紫外-可見吸收光譜有關的電子有三種，即形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子以及未參與成鍵的n電子。躍遷類型有：σσ*、nσ*、ππ

*、

nπ

*四種。2.1有機化合物的電子躍遷6精品PPT|實用可編輯第六頁，共五十一頁。

飽合有機化合物的電子躍遷類型為σ→σ*，n→σ*

躍遷，吸收峰一般出現在真空紫外區，吸收峰低于200nm，實際應用價值不大。

不飽合機化合物的電子躍遷類型為n→π*，π→π*

躍遷，吸收峰一般大于200nm。

7精品PPT|實用可編輯第七頁，共五十一頁。生色團：是指分子中可以吸收光子而產生電子躍遷的原子基團。人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團或結構系統定義為生色團。見表3-1和3-2。助色團：是指帶有非鍵電子對的基團，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當它們與生色團相連時，會使生色團的吸收峰向長波方向移動，并且增加其吸收強度。見表3-4。8精品PPT|實用可編輯第八頁，共五十一頁。紅移和紫移

在有機化合物中，常常因取代基的變更或溶劑的改變，使其吸收帶的最大吸收波長λmax發生移動。向長波方向移動稱為紅移(表3-3)，向短波方向移動稱為紫移。9精品PPT|實用可編輯第九頁，共五十一頁。2.2有機化合物的吸收帶吸收帶(absorptionband):在紫外光譜中，吸收峰在光譜中的波帶位置。根據電子及分子軌道的種類，可將吸收帶分為四種類型。R吸收帶

K吸收帶

B吸收帶

E吸收帶10精品PPT|實用可編輯第十頁，共五十一頁。3無機化合物的紫外-可見吸收光譜

鑭系和錒系元素的離子對紫外和可見光的吸收是基于內層f電子的躍遷而產生的。其紫外可見光譜為一些狹長的特征吸收峰，這些峰幾乎不受金屬離子的配位環境的影響。1.f電子躍遷吸收光譜11精品PPT|實用可編輯第十一頁，共五十一頁。過渡金屬的電子躍遷類型為d電子在不同d軌道間的躍遷，吸收紫外或可見光譜。這些峰強烈受配位環境的影響。例如cu2+以水為配位體，吸收峰在794nm處，而以氨為配位體，吸收峰在663nm處。此類光譜吸收強度弱，較少用于定量分析。2.d電子躍遷吸收光譜12精品PPT|實用可編輯第十二頁，共五十一頁。3.電荷遷移光譜某些分子既是電子給體，又是電子受體，當電子受輻射能激發從給體外層軌道向受體躍遷時，就會產生較強的吸收，這種光譜稱為電荷遷移光譜。如

苯酰基取代物在光作用下的異構反應。13精品PPT|實用可編輯第十三頁，共五十一頁。1.4影響紫外-可見吸收光譜的因素

物質的吸收光譜與測定條件有密切的關系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強度等都可能發生變化。1.溫度在室溫范圍內，溫度對吸收光譜的影響不大。14精品PPT|實用可編輯第十四頁，共五十一頁。2.溶劑注意如下幾點：（1）盡量選用低極性溶劑；（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩定性；（3）溶劑在樣品的吸收光譜區無明顯吸收。3.pH值15精品PPT|實用可編輯第十五頁，共五十一頁。1.5紫外-可見吸收光譜的應用

紫外-可見吸收光譜除主要可用于物質的定量分析外，還可以用于物質的定性分析、純度鑒定、結構分析。1.定性分析16精品PPT|實用可編輯第十六頁，共五十一頁。2.純度的鑒定用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。如蛋白質與核酸的純度分析中，可用A280/A260的比值，鑒定其純度。17精品PPT|實用可編輯第十七頁，共五十一頁。3.結構分析紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結構分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結構和芳環結構還是有一定價值。例如，某化合物在近紫外區內無吸收，說明該物質無共軛結構和芳香結構。18精品PPT|實用可編輯第十八頁，共五十一頁。§2.朗伯-比爾定律

設入射光強度為I0，吸收光強度為Ia,透射光強度為It，反射光強度為Ir，則I0=Ia+

It+Ir由于反射光強度基本相同，其影響可相互抵消，上式可簡化為：

I0=Ia+

It一、吸光度和透光度19精品PPT|實用可編輯第十九頁，共五十一頁。吸光度:為透光度倒數的對數，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度為透過光的強度It與入射光強度I0之比，用T表示：即T=It/I020精品PPT|實用可編輯第二十頁，共五十一頁。二、朗伯-比爾定律朗伯-比爾定律：當一束平行單色光通過含有吸光物質的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質濃度、液層厚度乘積成正比，即A=κcl

式中比例常數κ與吸光物質的本性，入射光波長及溫度等因素有關。c為吸光物質濃度，l為透光液層厚度。

朗伯-比爾定律是紫外-可見分光光度法的理論基礎。21精品PPT|實用可編輯第二十一頁，共五十一頁。三、吸光系數當l以cm，c以g/L為單位，κ稱為吸光系數，用a表示。A=acla的單位為L/(g.cm)22精品PPT|實用可編輯第二十二頁，共五十一頁。當l以cm，c以mol/L為單位，κ稱為摩爾吸光系數，用ε表示。ε的單位為L/mol.cm，它表示物質的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時，溶液的吸光度。摩爾吸光系數23精品PPT|實用可編輯第二十三頁，共五十一頁。比吸光系數比吸光系數是指百分含量為1%，l為1cm時的吸光度值，用表示。24精品PPT|實用可編輯第二十四頁，共五十一頁。四、偏離朗伯-比耳定律的因素（1）入射光為非單色光（3）光程的不一致性。光源不是點光源，比色皿光徑長度不一致，光學元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。（2）溶液的不均性。實際樣品的混濁，加入的保護膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發射等，均可吸光質點的吸光特性變化大。25精品PPT|實用可編輯第二十五頁，共五十一頁。§3.紫外-可見分光光度計一、主要部件的性能與作用基本結構:光源→單色器→吸收池→檢測器→信號顯示系統

↑

樣品26精品PPT|實用可編輯第二十六頁，共五十一頁。在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源

1光源熱輻射光源用于可見光區，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區，如氫燈和氘燈。27精品PPT|實用可編輯第二十七頁，共五十一頁。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。

2單色器單色器質量的優劣，主要決定于色散元件的質量。色散元件常用棱鏡和光柵。28精品PPT|實用可編輯第二十八頁，共五十一頁。吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區。

3吸收池吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。29精品PPT|實用可編輯第二十九頁，共五十一頁。4檢測器檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉變為電信號。現今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5信號顯示系統常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調節指零裝置，以及自動記錄和數字顯示裝置等。30精品PPT|實用可編輯第三十頁，共五十一頁。二、紫外-可見分光光度計的類型按其光學系統可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計。31精品PPT|實用可編輯第三十一頁，共五十一頁。1.單波長單光束分光光度計目前國內廣泛采用721型分光光度計。具有結構簡單、價格低廉、操作方便、維修也比較容易，適用于常規分析。單波長單光束分光光度計還有國產751型、XG-125型、英國SP500型和伯克曼DU-8型等。32精品PPT|實用可編輯第三十二頁，共五十一頁。PPT內容概述紫外分光光度計的使用原理和方法。（2）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學和光化學穩定性。c為吸光物質濃度，l為透光液層厚度。光源→單色器→吸收池→檢測器→信號顯示系統。在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉變為電信號。1.單波長單光束分光光度計。雙波長分光光度計的優點：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對某組分進行定量測定。A=lg1/T=εcl。dlgT=0.4343dT/T=-εldc。要使測定的相對誤差Δc/c最小，求導取極小得出：。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。對多種物質進行測定，常利用顯色反應將被測組分轉變為在一定波長范圍有吸收的物質。常見的顯色反應有配位反應、氧化還原反應等。其定量方法包括校準曲線法、標準對比法和吸收系數法。50第三十三頁，共五十一頁。2.單波長雙光束分光光度計單波長雙光束分光光度計有國產710型、730型、740型、日立UV-340型等就屬于這種類型。34精品PPT|實用可編輯第三十四頁，共五十一頁。3.雙波長分光光度計雙波長分光光度計的優點：是可以在有背景干憂或共存組分吸收干憂的情況下對某組分進行定量測定。國產WFZ800-5型、島津UV-260型、UV-265型等。35精品PPT|實用可編輯第三十五頁，共五十一頁。三、分光光度計的校正和檢驗1.波長校正2.吸光度校正3.雜散光的檢驗4.穩定性的檢驗36精品PPT|實用可編輯第三十六頁，共五十一頁。§4分析條件的選擇

一、儀器測量條件的選擇1.適宜的吸光度范圍由朗伯-比爾定律可知：A=lg1/T=εcl

微分后得：dlgT=0.4343dT/T=-εldc或0.4343ΔT/T=-εlΔc37精品PPT|實用可編輯第三十七頁，共五十一頁。代入朗伯-比爾定律有：Δc/c=0.4343ΔT/TlgT要使測定的相對誤差Δc/c最小，求導取極小得出：lgT=-0.4343=A即當A=0.4343時，吸光度測量誤差最小。

最適宜的測量范圍為0.2~0.8之間。38精品PPT|實用可編輯第三十八頁，共五十一頁。

通常是根據被測組分的吸收光譜，選擇最強吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當最強吸收峰的峰形比較尖銳時，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強峰或肩峰進行測定。

2.入射光波長的選擇39精品PPT|實用可編輯第三十九頁，共五十一頁。3．

狹縫寬度的選擇

為了選擇合適的狹縫寬度，應以減少狹縫寬度時試樣的吸光度不再增加為準。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的十分之一。40精品PPT|實用可編輯第四十頁，共五十一頁。

對多種物質進行測定，常利用顯色反應將被測組分轉變為在一定波長范圍有吸收的物質。常見的顯色反應有配位反應、氧化還原反應等。二、顯色反應條件的選擇41精品PPT|實用可編輯第四十一頁，共五十一頁。這些顯色反應，必須滿足以下條件：

4.反應生成物的組成恒定。3.反應生成的產物有足夠的穩定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；2．反應有較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應與共存物質的吸收光譜有明顯的差別；1．反應的生成物必須在紫外-可見光區有較強的吸光能力，即摩爾吸光系數較大；42精品PPT|實用可編輯第四十二頁，共五十一頁。1．酸度顯色反應最適宜的酸度范圍可通過實驗來確定：測定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度的變化，以吸光度為縱坐標，溶液的PH值為橫坐標作圖。3.顯色時間和溫度2.顯色劑的用量43精品PPT|實用可編輯第四十三頁，共五十一頁。

測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調節透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。三、參比溶液的選擇44精品PPT|實用可編輯第四十四頁，共五十一頁。精品PPT·收集整理第四十五頁，共五十一頁。參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有：1．