通過原位易錯PCR—步構建基因突變文庫王未未2張永昌2劉明杰2邵蔚藍1*【摘要】主要介紹一種通過原位易錯PCR構建隨機突變文庫的新技術。本實驗室最近發表的一項國際專利中，利用來源于海棲熱孢菌的極耐熱性DNA連接酶，在傳統PCR循環中加入一個連接步驟，即變性—退火—延伸—連接的四步循環法PCR，從而實現環狀質粒的PCR指數擴增(PPCP)。原位易錯PCR中所用引物為一段線性雙鏈DNA，它含有與模板質粒不同的篩選標記，產物轉化宿主菌后，模板質粒在篩選平板上被直接剔除。篩選到的陽性突變子可用作模板直接進入突變文庫的再次構建，通過篩選獲得二級或多級累加的正突變。利用這種方法構建了一個木聚糖酶基因和一個纖維素酶基因的隨機突變文庫，并篩選出具有正向突變的蛋白，證明以PPCP為基礎的原位易錯PCR技術，為基因定向進化提供了一種快速有效的隨機突變文庫構建的新方法。期刊名稱】微生物學通報年(卷),期】2014(041)004總頁數】6【關鍵詞】定向進化，隨機突變文庫，原位易錯PCR，環狀質粒擴增(PPCP)基因定向進化已經成為蛋白質工程中的一項重要技術。體外定向進化不僅為研究酶的底物特異性和確定酶的催化活性位點、改善酶的熱穩定性以及提高酶的作用溫度等方面提供了強有力的手段，而且有助于了解蛋白結構與功能之間的關系［1-5］。在分子生物技術的發展過程中人們不斷地發展基因體外進化和重組的方法，現在已經建立了多種用于構建隨機突變文庫的方法［6］。最常用的隨機突變的方法是易錯PCR［7］。其原理是在PCR過程中通過調整Mg2+和Mn2+濃度等因素，提高Taq酶在擴增過程中引入錯配堿基的頻次，導致目標基因的擴增產物發生適量的隨機突變［8］。早期的通過易錯PCR構建突變文庫的步驟包括：⑴以目標基因為模板在易錯條件下進行PCR，擴增出含有錯配堿基的突變基因；(2)對易錯PCR產物和表達載體進行酶切；(3)用DNA連接酶將突變基因連接到表達載體上；(4)將重組的表達載體導入宿主細胞，獲得帶有各種不同突變基因的重組細胞群體，即基因突變文庫。構建一個多樣化的基因突變文庫，需要從成千上萬個轉化子中篩選出所需要的正突變基因；上述方法就顯得很繁瑣，工作量很大［9-12］。另外，用Taq酶進行的易錯PCR會在DNA鏈的3’末端帶一個多余的堿基，因此在克隆前還需要修補DNA鏈或去除此堿基［13］。而且通過這種方法構建的文庫中常常會產生不帶有目的基因片段或是帶有多個目的基因片段的質粒［14］。因此早期發明的突變文庫的構建方法步驟繁瑣、效率低下。為了提高構建基因突變文庫的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002年提出特大引物全質粒擴增法(Mega-WH0P)［15］;Wei等2004年對這個技術進行了改進和發展［16］。該擴增方法以隨機突變后的目標基因作為雙鏈互補的引物對(即特大引物，Megaprimers)，以含有原始基因的表達質粒為模板(將此模板質粒甲基化)，采用高保真DNA聚合酶進行PCR，擴增出質粒的全長片段；再用DpnI酶處理，將甲基化了的模板質粒降解，而新擴增出的質粒因為沒有被甲基化，所以被完整保留。由于沒有DNA連接酶存在，利用引物和質粒模板單向延伸產生的線性DNA新鏈不能作為模板進行下一輪的擴增，Mega-WH0P法不能實現指數擴增；此外，這種方法在轉化突變產物前還需要使用類似于DpnI這樣的酶來進行一個模板消化的過程，步驟繁瑣。為解決以上問題，本文介紹一種新型的通過原位易錯PCR構建隨機突變文庫的方法，為廣大科技工作者提供一個更為方便快捷的構建隨機突變文庫的方式。1原位易錯PCR(Insituerror-pronePCR)技術原位易錯PCR技術是本實驗室最近發表的一項國際專利中公布的一種最新方法(PCT專利公開號：US-2012-0004142-A1)[17]。該發明專利的主要創新點包括：(1)用一種極耐熱性DNA連接酶，在傳統PCR循環中加入一個連接步驟，即“變性—退火—延伸—連接”的四步循環，從而實現環狀質粒的PCR指數擴增(PPCP)；⑵PPCP和易錯PCR相結合，在表達載體中對目標基因進行原位易錯PCR，產生帶有隨機突變基因的環狀質粒文庫；(3)在原位易錯PCR過程中更替篩選標記，產物與模板在平板篩選中自行分離。通過原位易錯PCR進行基因定向進化的基本步驟如圖1所示，將目標基因克隆到表達載體中構建成表達質粒；同時，從序列互補但是帶有不同抗藥基因的載體質粒中擴增出線性載體DNA；再以表達質粒為模板，線性載體DNA作引物，利用TaqDNA聚合酶在易錯條件下對表達質粒中的目標基因進行延伸；再通過極耐熱性連接酶的連接作用，擴增出帶有突變基因的可直接用于轉化的環狀質粒，實現通過易錯PCR一步構建基因突變文庫。這種方法省略了限制性酶切、酶連等繁瑣且低效的操作，可以用PCR產物直接進行轉化。另外，由于引物片段中的抗性基因與PCR反應中加入的模板質粒所帶的抗性基因不同，無需對模板質粒進行降解，可直接將PCR產物轉化后通過不同的篩選標記選擇性地培養含突變基因的轉化子，將基因突變產物與原始模板分離，完全排除模板質粒對轉化的影響。2原位易錯PCR技術的特點2.1原位易錯PCR與MegaWHOP的不同之處原位易錯PCR和MegaWHOP兩種方法雖然都要用到易錯PCR技術，但是它們在本質上有所區別(表1)。雖然MegaWHOP的試劑盒已經在美國市場上銷售，其方法并不符合PCR的基本原理；由于非指數擴增，并且主要產物不是雙鏈環狀的DNA，MegaWHOP的效率勢必走低。原位易錯PCR因基因在表達載體中的原位被誘導隨機突變而得名，所用的引物是通過高保真性擴增的同源載體的線性雙鏈DNA;相對于MegaWHOP的特大引物(Megaprimer)而言，原位易錯PCR所用的引物可謂“超(級)大引物”，在國際專利中被稱為載體引物(Vector-primer)。“超大引物”與“特大引物”之間的另一個區別在于超大引物具有通用性。Mega-WHOP中所用的特大引物必須針對目標基因及易錯條件特別制備，適宜的片段大小為0.2-1.0kb;原位易錯PCR中所用的“超大引物”是一個載體系列的公共序列，不論克隆到載體中的是哪一個基因，都可以用同一種引物進行原位易錯PCR。原位易錯PCR引物的通用性和操作的簡易性為我們帶來更大的便利是正突變的多輪疊加。如圖2所示，當備有兩套帶有不同篩選標記(如Ampr或Kanr)的超大引物時，可以輪番運用這兩套引物，在篩選到正突變基因的基礎上繼續進行隨機誘變和篩選，獲得二級或多級累加的正突變。2.2原位易錯PCR的技術要點環狀質粒的PCR擴增(PPCP)技術中所使用的DNA連接酶需要有高度的熱穩定性。經過研究，來自極端嗜熱菌Thermotogamaritima(Tma)的DNA連接酶在95°C的半衰期超過30min，適合用于PCR過程［18］。TmaDNA連接酶只對粘性末端有連接作用，對平端則沒有連接作用，因此此酶在反應中只將PCR產物連成環狀，不會對雙鏈的超大引物進行相互連接或自身環化。TmaDNA連接酶連接過程中需要二價離子如Mg2+、Mn2+和Ca2+等的參與；其中添加Mn2+既可以增強連接作用，也是易錯PCR常用的誘導堿基錯配的條件。值得注意的是，此酶在反應過程中需輔酶NAD+，因此，PPCP反應體系中一定要添加NAD+。超大引物和普通PCR引物的要求一樣，要求3端的序列具有較強的特異性。因為充當超大引物的雙鏈DNA片段變性解鏈后，正負鏈各自與互補的模板鏈退火成為引物，所以這段雙鏈DNA的兩端序列都應當具有特異性。設計超大引物時應盡量避免在末端使用非編碼區的常見序列，如很多基因共有的類似啟動子、終止子、轉錄起始位點至起始密碼子之間的引導序列等。超大引物可以通過PCR方法合成：以載體質粒為模板，合成一對普通引物，用高保真性且產生平末端的DNA聚合酶，如Pfu和Pyrobest等來擴增載體上的相應區域，包括選擇標記的編碼基因及兩側的其余序列。非常重要的是，PCR擴增的超大引物的5’端必需經過多聚核苷酸激酶進行磷酸化處理，才能在原位易錯PCR中實現新鏈的首尾連接從而產生環狀DNA。原位易錯PCR過程中，“變性—退火—延伸—連接”四步循環的溫度是個有趣的問題。由于使用的引物非常大：除了篩選標記基因以外，篩選標記的上游和下游各有幾百個與模板序列互補的堿基，其退火溫度可高于65°C；Taq酶的最適聚合溫度為72°C,但是在60°C也有較高的活性；TmaDNA連接酶的最適連接溫度是60°C,但是在70°C的活性高達最高活性的80%[18]。因此，原位易錯PCR過程中除變性溫度為94°C以外，退火、延伸與連接的溫度非常接近，都可以在65-72°C之間選擇，甚至可以合并為一步任其連續進行。有效的平板篩選技術或高通量篩選方法是利用原位易錯PCR技術進行基因定向進化的必要條件。對于許多酶基因實施定向進化，平板篩選技術的缺乏是主要瓶頸問題，但是這個問題不在本文討論之列。3原位易錯PCR應用實例在中國發明專利(ZL200910025925.0)文獻中介紹的實例包括一個木聚糖酶和一個纖維素酶基因的定向進化過程和試驗條件［19］。實例中采用pHsh系列載體構建表達質粒，其優點包括：(1)載體質粒小，轉化率高；(2)載體系列中有不同篩選標記供選擇；(3)該系統質粒為溫控型，可以通過在不同溫度下培養來控制表達水平［20］。試驗流程如圖1所示，實驗者首先將嗜熱疏棉狀絲孢菌的木聚糖酶基因xynA和海棲熱袍菌纖維素酶基因celB分別克隆到帶有抗藥基因Ampr的載體pHsh-amp(Gen-BankaccessionNo.FJ571619)中構建成表達質粒pHsh-xynA［21］和pHsh-celB；再用一對小引物擴增同一系列的帶有抗藥基因Kanr的載體pHsh-kan(GenBankaccessionNo.FJ571619)，產生的線性dsDNA經過磷酸化即可用作超大引物。原位易錯PCR在20pL反應體系中進行，含有pHsh-xynA或pHsh-celB模板DNA30ng帶有Kanr的超大引物DNA200ng,TaqDNA聚合酶0.5U,極耐熱性TmaDNA連接酶0.1pg,以及0.2mmol/LdNTPs,2.0mmol/LMgCl2,0.5mmol/LMnCl2,0.5mmol/LNAD+和PCR緩沖液。這次試驗中采用的PCR循環程序為：95°C5min;94°C1min,72°C1.5min,60°C2min,共15個循環；60°C10min。瓊脂糖凝膠電泳分析結果表明，加入TaqDNA聚合酶和TmaDNAligase的PCR反應中,環狀質粒條帶中DNA量有明顯的提高［19］。PCR產物轉化E.coliJM109感受態細胞（PromegaCorp，Madison，WI，USA），將pHsh-xynA的易錯PCR產物涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的LB培養基平板上，將pHsh-celB的易錯PCR產物涂布在含有2%CMC和卡那霉素的LB培養基平板上，分別放置在30°C恒溫培養箱中培養10h后轉到42°C恒溫培養箱中進行誘導表達5-6h［20］（圖3），菌落周圍的透明圈或凹陷圈的大小表明基因突變導致酶活性發生很大的變化。4總結自1993年第一次成功運用易錯PCR以來［22］，在短短的十幾年中，各種進化方法層出不窮。文中介紹的原位易錯PCR方法適用于任何可用于克隆的表達載體，最好使用能夠在大腸桿菌中表達的載體。已知的適用于此方法的選擇標記也有很多，比如文中所使用的抗性基因。同樣，需要突變的目的基因也可以是任何編碼序列。可以是一個蛋白的全長編碼序列，也可以是一段RNA序列或一段調控序列等。此方法中連接反應和PCR反應同步進行，建議參考文中提供的反應溫度設定熱循環程序。MnCl2濃度與易錯PCR的突變頻率相關，推薦濃度范圍為0.05-0.50mmol/L，建議對小于1kb的目標基因采用較高Mn2+濃度，對大于1kb的基因適當降低其濃度。極耐熱性TmaDNA連接酶和NAD+按照文中實例用量使用，其他酶和試劑濃度按常規PCR條件使用。此方法的反應條件需要根據具體情況，比如突變基因的大小、類型或研究者需要的突變率進行微調，并沒有具體的、通用的標準，這可能需要使用者根據實際情況對反應條件進行優化。突變子的篩選方法也因目標基因性質而異，與本技術沒有直接關系。參考文獻：ChirumamillaRR,MuralidharR,MarchantR,etal.Improvingthequalityofindustriallyimportantenzymesbydirectedevolution[J].MolecularandCellularBiochemistry,2001,224(1/2)：159-168.CherryJR,FidantsefAL.Directedevolutionofindustrialenzymes：anupdate[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2003,14(4)：438-443.EijsinkVG,GaseidnesS,BorchertTV,etal.Directedevolutionofenzymestability[J].BiomolecularEngineering,2005,22(1/3)：21-30.YuanL,KurekI,EnglishJ,etal.Laboratory-directedproteinevolution[J].MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,2005,69(3)：373-392.BhatMK.Cellulasesandrelatedenzymesinbiotechnology[J].BiotechnologyAdvances,2000,18(5)：355-383.OttenLG,QuaxWJ.Directedevolution：selectingtoday'sbiocatalysts[J].BiomolecularEngineering,2005,22(1/3)：1-9.[7]CadwellRC,JoyceGF.RandomizationofgenesbyPCRmutagenesis[J].PCRMethodsandApplications,1992,2(1)：28-33.KammannM,LaufsJ,SchellJ,etal.RapidinsertionalmutagenesisofDNAbypolymerasechainreaction(PCR)[J].NucleicAcidsResearch,1989,17(13)：5404.MiyazakiK,TakenouchiM.CreatingrandommutagenesislibrariesusingmegaprimerPCRofwholeplasmid[J].Biotechniques,2002,33(5)：1033-1038.NakaniwaT,TadaT,TakaoM,etal.Aninvitroevaluationofathermostablepectatelyasebyusingerror-pronePCR[J].JournalofMolecularCatalysisB-enzymatic,2004,27(2/3)：127-131.ZhangJH,DawesG,StemmerWP.DirectedevolutionofafucosidasefromagalactosidasebyDNAshufflingandscreening[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997,94(9)：4504-4509.KimMS,LeiXG.EnhancingthermostabilityofEscherichiacoliphytaseAppA2byerror-pronePCR[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,79(1)：69-75.HuG.DNApolymerase-catalyzedadditionofnontemplatedextranucleotidestothe3'endofaDNAfragment[J].DNAandCellBiology,1993,12(8)：763-770.[14]ShenB.PCRapproachestoDNAmutagenesisandrecombination：anoverview[J].MethodsinMolecularBiology,2002,192：167-174.MiyazakiK,TakenouchiM.CreatingrandommutagenesislibrariesusingmegaprimerPCRofwholeplasmid[J].Biotechniques,2002,33(5)：1033-1038.WeiD,LiM,ZhangX,etal.Animprovementofthesite-directedmutagenesismethodbycombinationofmegaprimer,one-sidePCRandDpnItreatment[J].AnalyticalBiochemistry,2004,331(2)：401-403.

ShaoW,LeY,PeiJ.Methodforconstructionmutagenesislibrariesinsitu[P].US,2012/0004142A1.2012-1-5.LeY,PengJ,PeiJ,etal.PropertiesofanNAD+-dependentDNAligasefromthehyperthermophileThermotogamaritimaanditsapplicationinPCRamplificationoflongDNAfragments[J].EnzymeandMicrobialTec